甘肃藏区牦牛酸乳中优良乳酸菌及其组合发酵性能研究

陈　亚，梁　琪，*，张　炎，黄绍海，秦　虹（.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃功能乳品工程实验室，甘肃兰州730070；.兰州雪顿生物乳业有限公司，甘肃兰州730050）

甘肃藏区牦牛酸乳中优良乳酸菌及其组合发酵性能研究

陈亚1，梁琪1，*，张炎1，黄绍海2，秦虹1
（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃功能乳品工程实验室，甘肃兰州730070；2.兰州雪顿生物乳业有限公司，甘肃兰州730050）

通过对甘肃藏区牦牛酸乳中5株性状优良乳酸菌间进行组合发酵筛选，得出最佳发酵组合，并进一步对其发酵性能进行研究，结果表明：嗜热链球菌Q4和德氏乳杆菌保加利亚亚种G4为最佳组合，且其发酵性能优于单菌，即在冷藏期间，组合菌株Q4-G4所发酵的酸奶的抗后酸化能力增强，活菌数（大于109CFU/mL）、黏度（7.4～8.61 Pa·s）均大于单菌株且变化幅度小，产香能力增强、风味更佳，胞外多糖含量（129.28 mg/mL）显著高于单菌株Q4、G4（p＜0.05）；与商业发酵剂YO-MIX300的发酵性能无显著性差异（p＞0.05）。组合菌株Q4-G4可以作为混合发酵剂投入到酸奶的工业化生产中。

牦牛乳，乳酸菌，组合，发酵性能

甘肃省甘南州和天祝县藏民采用传统方法制作的牦牛乳酸奶不仅组织状态细腻、风味及口感独特，而且在自然条件环境下存放较长时间还能保持其良好的品质，这表明当地藏区发酵牦牛乳中有遗传稳定性好、抗逆性强、发酵性能优良的乳酸菌菌群［1］。近年来，一些学者从我国不同地区的自然发酵牦牛酸乳中分离得到性状优良的乳酸菌，并对其发酵性能进行了研究。敖晓琳等［2］从甘牧、阿坝等牧区自然发酵牦牛乳中分离出120株乳酸菌进行传代实验，通过感官评价筛选出18株凝乳状态好、风味独特、遗传性状稳定的乳酸菌菌株。司克辉等［3］从甘肃肃南牧区自然发酵牦牛乳中分离得到的45株乳酸菌中筛选出6株感官评价良好的乳酸菌，进一步通过发酵性能研究得出其中两株具有优良发酵剂的潜能。秦虹等［4］从甘肃部分藏区采集自然发酵牦牛乳中分离出195株乳酸菌，并筛选出12株发酵性能优良的乳酸菌，进行酸化能力、后酸化能力、冷藏期间活菌数和黏度变化及产香能力的测定，最终选出5株性状优良的乳酸菌。上述针对甘肃甘南藏区优选的乳酸菌研究均为单一菌株的筛选和发酵性能研究，未进行多菌株混合发酵性能测试。

发酵剂的发酵性能对酸奶的品质起着决定性作用［5］，由不同的乳酸菌组成的发酵剂后酸化能力、产黏特性以及产风味物质能力等发酵性能不同［6］。乳酸菌混合发酵酸奶时，不仅可以提高酸奶中的氨基酸以及短肽的产量，使其具有更多的风味物质，从而改善酸奶的风味［7］，而且可以节约成本。Dorota等研究表明，德式乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌组合后所发酵的酸奶的凝乳时间缩短，滴定酸度增大［8］。国内也已有学者将不同地区的传统乳制品中筛选出的性能优良的乳酸菌组合后发酵酸奶，与单菌发酵相比，其产酸和产香性、感官风味更佳［9］。而甘肃藏区牦牛乳中乳酸菌之间的组合及发酵性能的研究在目前尚属空白，因此本研究以甘肃藏区发酵牦牛酸乳中分离出的5株性状优良的乳酸菌［4］为基础，筛选出最佳发酵组合并进行发酵性能的研究以期筛选出适合作为牦牛乳酸奶发酵剂的优良菌株组合，为发酵剂生产菌株的选择提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

乳酸乳球菌乳酸亚种Q3、嗜热链球菌Q4和德氏乳杆菌保加利亚亚种G3、G4、G5均由甘肃省功能乳品工程实验室筛选并保藏；YO-MIX300型（由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成）商业发酵剂丹麦丹尼斯克公司；脱脂乳粉黑龙江完达山乳业；双乙酰阿拉丁试剂有限（中国）公司；实验所用试剂均为分析纯；MRS培养基、改良M17培养基，按文献进行配制［10-11］。

PHS-3C pH计上海仪电科学仪器有限公司；TGL-20高速台式冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；LVDV-1型旋转式数显黏度计上海万磁仪器有限公司；754PC型紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1拮抗实验参照Vinderola等［12］的方法测定。采用交叉拮抗法进行拮抗实验，在球菌与球菌、杆菌与杆菌之间不做拮抗实验。将菌株Q3、Q4、G3、G4、G5在液体培养基中活化、培养，然后移取100 μL指示菌的培养液涂布于固体培养基上，将目标菌的培养液在4℃、330×g离心20 min，取上清液，以100片/mL制成供试菌代谢物药物纸片，再在每个已涂布有指示菌得到培养基上等距离贴放3张药物纸片，于37℃培养，若在纸片周围出现抑菌圈，则表明这两株菌之间有抑菌作用，即两菌间有拮抗现象，反之则无拮抗现象。

1.2.2最佳发酵组合的筛选将筛选出的优良乳酸球杆菌组合（其中将Q3和G3组合、Q3和G4组合、Q3和G5组合、Q4和G4、Q4和G4、Q4和G5依次命名为A1、A2、A3、B1、B2和B3）并按1∶1的比例、3%接种量接种到12%、含6%（g/100 mL）蔗糖的灭菌脱脂乳中，37℃发酵，记录凝乳时间，凝乳后置于4℃冷藏24 h，根据表1进行感官评价并测定滴定酸度、黏度和活菌数［13-15］，筛选出最佳球杆菌发酵组合。

表1　发酵乳感官评价表Table 1　The score table for sensory evaluation of fermented milk

1.2.3最佳组合菌株的发酵性能研究

1.2.3.1酸奶的制作取脱脂乳粉若干，用蒸馏水配制成12%的脱脂乳，向其中加入5%的蔗糖后均质（20 MPa，65℃），然后灭菌15 min，冷却后，以3%的比例接种并混匀，在37℃下进行发酵，凝乳后，在4℃下冷藏24 h得酸奶成品。

1.2.3.2后酸化能力的测定参照Franciosi等［16］的方法测定。将筛选得到的乳酸菌以3%比例接到12%灭菌脱脂乳中，在37℃下进行发酵，凝乳后置于4℃冷藏，后熟24 h后为贮存期第1 d，测定酸奶在贮存1、5、10、15、20、25 d时的滴定酸度。

1.2.3.3冷藏期间活菌数变化参照Elizabeth等［17］的方法测定。将在4℃冷藏了1、5、10、15、20、25 d的酸奶进行梯度稀释，用平板计数法测定冷藏期间各菌株活菌数的变化。

1.2.3.4冷藏期间黏度变化参照Celik和Bakirci等［18］的方法测定。将在4℃冷藏了1、5、10、15、20、25 d的酸奶用LVDV-1型粘度计在4℃下测定其黏度。

1.2.3.5产香能力的测定将活化好的菌株按3%的比例接种于12%（W/V）灭菌脱脂乳中，在37℃下培养，凝乳后置于4℃冷藏，从冷藏开始的0、12、24、36、48、60、72 h对酸乳样品中乙醛和双乙酰含量进行测定［19-20］，按下式计算乙醛含量。

式中：V1为样品滴定消耗的I2标准溶液的体积（mL）；V2为空白滴定消耗的I2标准溶液的体积（mL）；C为I2标准溶液的浓度（moL/L）；10为样品称样量（mL）；0.022为乙醛化学反应基本单位（g）。

1.2.3.6胞外多糖产量的测定［21］a.胞外多糖的提取：将制作好的酸奶在4℃冷藏4 h后，取10 mL酸奶，100℃水浴30 min后冷却，4℃、8000 r/min离心20 min，取上清液，加入5 mL、80%三氯乙酸，搅拌均匀，4℃、10000 r/min离心30 min。取上清液，加20 mL无水乙醇，4℃静置12 h，4℃、10000 r/min离心30 min，收集沉淀，用10 mL蒸馏水溶解，4℃、10000 r/min离心30 min，取上清液，加20 mL无水乙醇后，4℃静置12 h，4℃、10000 r/min离心30 min，沉淀用蒸馏水溶解定容至10 mL。

b.葡糖糖标准曲线的绘制：准确称取葡萄糖标品100 mg（105℃烘至恒重）溶于500 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。分别吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL葡萄糖标准溶液，用蒸馏水补至2.0 mL，然后加入2.0 mL、6%苯酚溶液及10.0 mL浓硫酸，静止10 min，摇匀，室温放置20 min后，于490 nm波长下测定其吸光值，蒸馏水作为空白对照，以标品含量为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线。

c.样品中胞外多糖含量的测定：取2.0 mL提取的粗多糖溶液于试管中，加入2.0 mL、6%苯酚溶液及10 mL浓硫酸，静置10 min，摇匀并放置在室温下20 min后，于490 nm处测其吸光度值，在标准曲线上查得样品中多糖含量。

1.3数据处理

实验中每个处理重复三次，采用SPSS 17.0软件进行数据的显著性分析，应用Origin 7.0软件作图。

2　结果与分析

2.1菌株的组合发酵

2.1.1拮抗实验由表2可以看出，球菌Q3、Q4与杆菌G3、G4、G5之间均无抑制作用。因此，乳酸乳球菌乳酸亚种Q3、嗜热链球菌Q4与德氏乳杆菌保加利亚亚种G3、G4、G5可以相互混菌进行酸奶发酵。

表2　单菌拮抗实验结果Table 2　Results on the antagonistic experiment between Lactobacillus and Lactococcus

2.1.2最佳发酵组合的筛选对菌株进行组合发酵是利用菌株的协同作用，使各菌株的优势在产品中一起表现出来。球杆菌发酵组合的筛选结果见表3。

表3　组合发酵实验结果Table 3　The results of combined fermentation experiment

从表3可以看出，6组发酵组合的凝乳时间均比对照组长，组合B2的凝乳时间最短（296.67 min），对照组与组合B2差异不显著（p＞0.05）、与其他组差异显著（p＜0.05），组合B2与组合A2差异不显著（p＞0.05）、与组合A1、A3、B1、B3差异显著（p＜0.05）；6组发酵组合的滴定酸度在84.50～99.38°T之间，符合GB/T 5413.34-2010对发酵乳产品要求的滴定酸度（＞70°T），组合A2、A3、B3滴定酸度大于98°T，显著高于对照组（p＜0.05），会使酸奶酸味偏重，组合B2与对照组差异不显著（p＞0.05），组合A1、B1滴定酸度显著的低于对照组（p＜0.05）；组合B2的黏度与对照组差异不显著（p＞0.05），组合B2与对照组的黏度显著高于其他实验组（p＜0.05），其黏度为7.99 Pa·s；6组发酵组合中的活菌数均大于106CFU/mL，符合GB/T5413.34-2010的要求，其活菌数均显著高于对照组（p＜0.05），组合A3活菌数最大为10.05 lgCFU/mL，组合B2次之，活菌数为9.65 lgCFU/mL；组合B2、对照组的感官评价评分显著的高于其他实验组（p＜0.05），组合B2与对照组差异不显著（p＞0.05），其感官评价评分为88.57。综上所述，组合B2的综合评价结果最好，为最佳发酵组合，即菌株Q4与G4的组合为最佳组合。

2.2最佳发酵组合的发酵性能研究

2.2.1后酸化能力乳酸菌的后酸化是导致酸奶在贮藏过程中品质发生变化主要原因之一。酸奶在冷藏期间滴定酸度随时间的变化结果见图1。

图1　发酵乳冷藏期间酸度的变化趋势Fig.1　The change of acidity of yogurt during cold storage

从图1可以看出，在冷藏过程中，各菌株发酵的酸奶的滴定酸度都有不同程度的增大，菌种组合后发酵的酸奶的滴定酸度介于球、杆菌单菌株发酵酸奶滴定酸度之间，而且酸度增加值显著小于单菌株（p＜0.05），这是因为球杆菌组合发酵酸奶时充分利用了球菌后酸化能力弱的特点［22］；Q4-G4滴定酸度变化与Q4、G4的差异显著（p＜0.05），显著大于YO-MIX300的滴定酸度（p＜0.05）。在整个冷藏的过程中，Q4-G4所发酵的酸奶的滴定酸度增加了13.37°T，显著低于Q4、G4发酵酸奶的酸度增加值（分别为15.92°T、21.06°T），与YO-MIX300发酵酸奶的酸度增加值（12.66°T）差异不显著（p＞0.05）。因此，菌株组合后发酵酸奶，其抗后酸化能力增加了。

2.2.2冷藏期间活菌数的变化酸奶中含有大量活菌是体现酸奶具有益生功能的指标，而且国标GB/T 5413.34-2010规定，酸奶产品中的乳酸菌活菌数应大于106CFU/mL。在冷藏期间活菌数随时间的变化如图2所示。

图2　发酵乳冷藏期间活菌数的变化Fig.2　The change of LAB counts in the yoghurt during cold storage

从图2可以看出，在冷藏期间，Q4、G4、Q4-G4、 YO-MIX300发酵的酸奶的活菌数均大于107CFU/mL，符合国标GB/T 5413.34-2010中对酸奶中的乳酸菌活菌数的要求，而且都在第5 d时活菌数最高，均大于8.90 lgCFU/mL，之后活菌数开始下降。Q4、G4发酵的酸奶中的活菌数在冷藏的1～5 d比Q4-G4所发酵的酸奶中的活菌数要高，在冷藏的5～10 d Q4所发酵酸奶的活菌数高于Q4-G4所发酵的酸奶中的活菌数，而G4所发酵酸奶的活菌数低于Q4-G4所发酵的酸奶中的活菌数，但在冷藏15 d以后，Q4、G4发酵的酸奶中的活菌数下降幅度较大，在7.30 lgCFU/mL以上；而Q4-G4所发酵酸奶中的活菌数在冷藏的15 d以后下降幅度较小，在8.75 lgCFU/mL以上。在整个冷藏过程中，YO-MIX300活菌数的降低幅度也较小；Q4-G4发酵酸奶的活菌数的变化与Q4差异不显著（p＞0.05），但与G4差异显著（p＜0.05），而且明显大于YO-MIX300所发酵的酸奶的活菌数。因此，菌株组合后发酵的酸奶在货架期内会保持较高的活菌数，从而更好地发挥酸奶的益生作用。

2.2.3冷藏期间黏度的变化乳酸菌的产黏能力也是筛选发酵剂菌株的指标之一。发酵乳的黏度除了受菌株产胞外多糖能力影响外，还与冷藏后熟过程中菌株的后酸化能力和贮藏时间有关。各菌株在冷藏期间黏度的变化情况如图3所示。

图3　发酵乳冷藏期黏度的变化Fig.3　The viscosity variation trend of yoghurt during cold storage

从图3可知，在整个冷藏过程中，所有菌株发酵的酸奶的黏度都呈现先增大后减小的趋势，Q4和Q4-G4发酵的酸乳在第10 d黏度达最大，分别为7.75、8.61 Pa·s；G4在第15 d时黏度达最大，为7.83 Pa·s；YO-MIX300在第5 d时达最大，为8.88 Pa·s。Q4-G4发酵的酸奶黏度显著大于Q4、G4发酵酸奶的黏度（p＜0.05），且组合Q4-G4发酵的酸奶黏度的变化小于菌株单独发酵的黏度变化，研究结果与李志成等［23］的一致；与YO-MIX300发酵酸奶的黏度差异不显著（p＞0.05）。组合Q4-G4发酵的酸奶黏度的变化小于菌株单独发酵的黏度，说明菌株经组合后发酵的酸奶的稳定性较好。

2.2.4产香能力的测定乙醛和双乙酰是构成酸乳典型风味的重要化合物，分析其含量和风味的关系，对酸乳的生产有着重要的意义。各菌株在冷藏期间产生的乙醛和双乙酰含量随时间的变化分别见图4和图5。

图4　发酵乳乙醛含量的变化Fig.4　The change of acetaldehyde in the yoghurt

从图4可以看出，在冷藏的72 h内，各酸奶中乙醛含量都呈现先增大后减小的趋势，Q4和YO-MIX300都在第12 h达最大，最大值分别为39.97、35.27 μg/mL，Q4-G4在第24 h时达最大，为38.79 μg/mL，G4在第36 h达最大，为33.37 μg/mL。组合Q4-G4发酵的酸奶中乙醛含量总体上大于单菌株发酵的酸奶。Q4-G4所发酵的酸奶中乙醛含量与Q4发酵的酸奶的乙醛含量差异不显著（p＞0.05），与G4和YO-MIX300发酵的酸奶中乙醛含量差异显著（p＜0.05）

图5　发酵乳中双乙酰含量的变化Fig.5　The change of diacetyl in the yoghurt during cold storage

从图5可以看出，在冷藏的72 h内，各酸奶中的双乙酰含量也都呈现先增大后减小的趋势，都在第12 h时达最大，Q4、G4、Q4-G4、YO-MIX300最大含量分别为11.36、10.58、10.77、9.28 μg/mL。组合Q4-G4发酵的酸奶中所含的双乙酰含量总体上只小于单菌株Q4发酵的酸奶，但在发酵后期48～72 h小于各单菌株所发酵的酸奶，这与顾瑞霞等［24］的研究结果一致。且菌株组合后发酵的酸奶中双乙酰含量与Q4发酵的酸奶差异显著（p＜0.05），与G4和YO-MIX300发酵的酸奶差异不显著（p＞0.05）。

在同一冷藏期内，Q4、G4、Q4-G4、YO-MIX300发酵的酸奶中乙醛含量/双乙酰含量分别为2.69～4.12、2.63～4.90、2.78～6.32、3.16～5.05之间。组合Q4-G4发酵的酸奶中乙醛含量与双乙酰含量的比值大于单菌株的比值，所以菌株经组合后发酵的酸奶的风味更协调。

图6　葡萄糖标准曲线Fig.6　Standard curve of glucose concentration

图7　发酵乳中胞外多糖的含量Fig.7　Exopolysaccharide content in the yoghurt

2.2.5胞外多糖产量的测定乳酸菌产生的胞外多糖既可以提高菌体对肠道表面的非特异性粘附，又具有降胆固醇、抗肿瘤、调节免疫及血压等生理功能，同时也能够提高乳制品的黏度、保水性和稳定性，使口感、质地和风味变得更好［25］。酸奶在冷藏期间产生的胞外多糖含量（图7）由标准曲线（图6）可得知。

从图7可以看出，Q4、G4、Q4-G4、YO-MIX300发酵的酸奶中胞外多糖的含量分别为89.43、58.56、129.28、132.10 mg/L，组合Q4-G4发酵的酸奶中胞外多糖的含量显著的大于Q4、G4（p＜0.05）；与YO-MIX300发酵酸奶中胞外多糖含量差异不显著（p＞0.05）。因此，Q4、G4组合后，发酵的酸奶中所含的胞外多糖含量增多，从而导致黏度增大。

3　结论

本实验通过组合发酵筛选得出，Q4-G4为最佳组合，且其发酵性能显著优于单株菌，其发酵的酸奶中活菌数显著大于商业发酵剂YO-MIX300发酵酸奶中的活菌数（p＜0.05）；同时，组合Q4-G4发酵的酸奶在冷藏期间，滴定酸度增加值（13.37°T）显著低于单菌株（p＜0.05）；活菌数（大于109CFU/mL）、黏度（7.4～8.61 Pa·s）均大于单菌株且变化幅度小；乙醛和双乙酰含量的比例（2.78～6.32）协调，酸奶风味更佳；其发酵的酸奶中胞外多糖含量（129.28 mg/mL）显著高于单菌株（p＜0.05）。

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Study on combination fermentation and performance of lactic acid bacteria from yak milk in Tibetan Pastoral Areas

CHEN Ya1，LIANG Qi1，*，ZHANG Yan1，HUANG Shao-hai2，QIN Hong1
（1.Functional Dairy Engineering Laboratory in Gansu Province，College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Lanzhou XueDun’s Biological Dairy Industry Limited Corporation，Lanzhou 730050，China）

Five strains from yak milk in Tibetan Pastoral Areas with better fermentation performance were mixed，and their best fermentation combination was studied.The results showed that Thermophilic streptococcus Q4 and lactobacillus Bulgaricus subspecies G4 were the best combination，and its performance was superior to that of the single bacterium.The antipost-acidification capability of the yogurt which was fermented by Q4-G4 increased，and both the number of living bacterium（greater than 109cfu/mL）and viscosity（7.4～8.61 Pa·s）were higher than that of the single strain，and the aroma-producing capacity improved.All of these kept the yogurt flavor better.Additionly extracellular polysaccharide content of the yogurt（129.28 mg/mL）was significantly higher than that of single strain.There was not significant difference both Q4-G4 and the commercial starter cultures YO-MIX300 in fermentation performance.Therefore，Q4-G4 could be used mixed starter culture and applied into yogurt industralization production.

yak milk；lactic acid bacteria；combination；fermentation performance

TS201.3

A

1002-0306（2015）20-0191-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.032

2015－02－05

陈亚（1987-），女，硕士研究生，研究方向：乳品微生物，E-mail：chenya1224@126.com。

梁琪（1969-），女，教授，研究方向：食品品质、乳品科学，E-mail：liangqi@gsau.edu.cn。

兰州市研政产合作项目（2012-2-87）；兰州市科技创新人才团队培育计划项目（2011-1-144）。