大黄抑制食源性致病菌的活性成分研究

侯媛媛，吴文惠，许剑锋，宋益善（上海海洋大学食品学院，上海201306）

大黄抑制食源性致病菌的活性成分研究

侯媛媛，吴文惠，许剑锋，宋益善*
（上海海洋大学食品学院，上海201306）

研究了大黄对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，初筛的结果显示大黄醇提物对这3种菌均有较强的抑菌作用，并发现其中抑菌作用最强的物质分布在大黄氯仿段萃取物中。利用UPLC-MS-MS分析大黄氯仿段萃取物，发现大黄氯仿段萃取物的主要成分分别是大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素甲醚和大黄酚。在这五种化合物中，大黄酸对大肠杆菌和沙门氏菌具有最强的抑菌效果，对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度分别为125 μg/mL和250 μg/mL，最小杀菌浓度分别为250 μg/mL和500 μg/mL，大黄素对于金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌效果，最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为62.5 μg/mL和125 μg/mL。

大黄，抑菌，大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌

食源性疾病是较为常见的一类影响人类健康的问题，在美国，每年约有1/6的人由于食用被微生物污染的食物或是饮料而导致疾病发生。通常，人们会用抗生素来治疗各种细菌感染。然而，菌对合成的抑菌剂逐渐产生抗性，且抑菌剂具有毒性引起人们的关注。因此，从可使用的中药中寻找新型的抑菌化合物显得极为重要。

近年来随着广谱抗生素的广泛应用，耐药细菌不断增多，特别是像大肠杆菌这些高度变异菌株，耐药性尤为突出［1-3］。目前，医学界一直致力于寻找安全有效的抗菌药物。中草药是我国医学宝库中最珍贵的财富之一，它存在很多活性强、毒性低的有效成分，如大黄提取物具有较强的抑菌效果，然而，提取物中的主要抑菌成分鲜有报道。

大黄的根是中国最为常用的中药之一，开始被人们用作泻药治疗便秘、黄疸和胃肠出血等疾病［4］，近年来，随着研究的深入，人们发现大黄具有广泛的生物活性，主要包括抑菌、抗癌、抗炎和抗氧化［5-7］等。许多研究表明大黄具有广谱的抗菌作用，Lu等［5］研究发现大黄蒽醌类化合物对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为50～200 μg/mL，李国旺等［8］发现大黄水提液对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌以及绿脓杆菌具有不同程度的抑制作用，苟奎斌等［9］发现大黄对幽门螺杆菌具有较强的抑制作用。虽然已经有人对大黄的抑菌作用有了较为广泛的研究，但大多是研究大黄粗提物的抑菌作用，而对大黄中起抑菌作用的主要活性化合物鲜有报道，所以本文研究追踪大黄对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用的主要活性化合物，为天然植物提取物作为抑菌剂提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

掌叶大黄购自上海同济大药堂；乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、DMSO均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基购于杭州天和微生物有限公司；碘硝基四唑紫（INT）购于生物生工股份有限公司；供试菌种包括大肠杆菌（Escherichia coli ATCC25922）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica subsp enterica CMCC50041）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923）购于中国科学院微生物研究所。

JSP-1000A小型粉碎机浙江省永康市金穗机械制造厂；RE-52A旋转蒸发仪上海青浦沪西仪器；DRT-TW调温电热套巩义市予花仪器有限责任公司；数显恒温水浴锅上海博讯实业有限公司；ESCO垂直流超净工作台新加坡ESCO公司；MLS-3750全自动高压蒸汽灭菌锅日本三洋；DHG-9243BS-Ⅲ电热鼓风恒温干燥箱上海新苗医疗器械制造有限公司；CT14RD台式高速冷冻离心机上海天美生化仪器设备工程有限公司；Waters Acquity超高效液相色谱美国Waters；Waters Xevo G2 Q-TOF质谱仪美国Waters。

1.2实验方法

1.2.1大黄提取和萃取称取药材大黄200 g，粉碎后放入1000 mL回流瓶，倒入200 mL无水乙醇70℃回流煮沸5 h，倒出提取液经减压抽滤后，倒入旋转蒸发瓶，65℃减压旋转蒸发，将溶剂再次倒入回流瓶，回流煮沸，重复5次，得到膏状提取物22.4 g。称取10 g大黄乙醇提取物，溶入100 mL去离子水中，得到混浊的水悬浮液，摇匀，装入1000 mL分液漏斗中，分别用石油醚萃取5次（每次100 mL），合并石油醚萃取液，减压回收石油醚，制得浆状石油醚组分；水相继续用氯仿萃取5次（每次100 mL），合并有机相，减压浓缩，制得氯仿组分；按照相同方法依次得到乙酸乙酯组分，正丁醇组分和剩余的水组分。不同组分的萃取物置于4℃冰箱备用。提取和萃取流程见图1。

图1　大黄提取和分段萃取流程Fig.1　The process of extraction by ethanol and further fractionation

1.2.2大黄醇提物和各萃取组分的抑菌活性参照Chan等的方法［10］测定抑菌圈直径，略有改动。将大黄5种分段萃取物和大黄醇提物分别配制成浓度为0.01 g/mL的溶液。将活化后的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌菌液浓度调整至107CFU/mL，用移液枪取0.1 mL，均匀涂布于制备好的平板上，置于37℃的恒温培养箱中10 min，使表面干燥，用无菌镊子将滤纸片贴在培养基表面，轻压纸片以确保接触良好，然后吸5 μL 0.01 g/mL的样品滴于滤纸片表面并做标记。37℃下恒温培养24 h，观察抑菌圈大小并测定其直径，滤纸片实验重复3次取平均值。

1.2.3最小抑菌浓度（MinimumInhibitory Concentrations）和最小杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentrations）的测定96孔板微量稀释法：参照NCCLS［11］将大肠杆菌和沙门氏菌菌液浓度调整至105～106CFU/mL，将样品溶解于DMSO中，样品浓度配制成2000 μg/mL，经2倍系列稀释，得到系列浓度为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81 μg/mL。实验组每孔加入50 μL菌液和50 μL样品，对照组只加入50 μL菌液和50 μL DMSO，将96孔板置于恒温培养箱中37℃条件下培养24 h，取出，每孔加入10 μL的INT溶液，染色30min后观察颜色变化，活细胞经INT染色后变成紫色，若没有活细胞则不变色，颜色没有发生变化的最小浓度即为最低抑菌浓度，培养48 h后染色颜色没有变化的最小浓度为最小杀菌浓度。

1.2.4大黄氯仿段萃取物UPLC-MS-MS分析称取1 mg干燥的大黄氯仿萃取组分，溶解于10 mL的甲醇中，得到浓度为100 μg/mL的溶液，常温下超声5 min，用0.22 μm滤膜过滤，备用。

色谱条件：超高效液相色谱（UPLC）：Waters Acquity超高效液相色谱。色谱柱：BEH C18。流动相为：A为0.5%甲酸水溶液，B为乙腈。流速为0.4 mL/min，初始为A∶B=70∶30，之后匀速变化，4.5 min到达A∶B= 40∶60，在5 min时改变流动相为A∶B=20∶80，5.1 min时流动相瞬间变为A∶B=70∶30运行时间为1.9 min。柱温40℃，进样体积5 μL。

质谱条件：仪器：Waters Xevo G2 Q-TOF质谱仪；电离源：ESI负离子源；质量扫描范围：100～1000；毛细管电压：2.5 kV；锥孔电压：35 V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；锥孔气流速：50 L/h；脱溶剂气流速：800 L/h；二级质谱碰撞能量：35 Ev。

2　结果与分析

2.1大黄醇提物和分段萃取物的抑菌圈直径

表1为大黄乙醇粗提物和5种分段萃取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径的结果，六种溶液对大肠杆菌的抑菌圈直径大小为：氯仿萃取部分＞乙醇提取物=石油醚萃取部分＞乙酸乙酯萃取部分＞正丁醇萃取部分＞水萃取部分；对沙门氏菌的抑菌圈直径大小为：氯仿萃取部分＞乙醇提取物＞石油醚萃取部分＞乙酸乙酯萃取部分＞正丁醇萃取部分=水萃取部分；对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大小为：氯仿萃取部分＞乙醇提取物＞乙酸乙酯萃取部分＞石油醚萃取部分＞正丁醇萃取部分＞水萃取部分。说明大黄氯仿段萃取物对大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌有最好的抑菌效果。

2.2大黄醇提物和分段萃取物的最小抑菌浓度

表1　大黄醇提物和各分段萃取物的抑菌圈直径Table 1　Diameters of inhibition zone of rhubarb crude extract and five fractions

表2　大黄醇提物和分段萃取物的最小抑菌浓度Table 2　The MIC of rhubarb crude extract and five fractions against 3 strains

从表2可以看出，大黄氯仿组分与大黄乙醇粗提物对3种菌的最小抑菌浓度相同，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为6.25、12.5、3.16 mg/mL。与各萃取组分相比，最小抑菌浓度值最小，说明大黄氯仿段萃取物的抑菌效果最好。为了追踪最为有效的抑菌单体化合物，接下来用UPLCMS-MS分析氯仿组分的组成成分。

2.3UPLC-MS/MS分析大黄氯仿部分组成成分

通过图2和表3以及对比Wei等［12］的研究结果，可知液相色谱图中标出的化合物依次为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。

图2　大黄氯仿萃取部分的液相色谱图Fig.2　UPLC chromatogram of the five major compounds identified from chloroform fraction of rhubarb crude extract

2.45种化合物的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

从表4可知大黄酸和大黄素对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑菌效果，大黄酸对大肠杆菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为125和250 μg/mL，对沙门氏菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为250和500 μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为125和250 μg/mL；大黄素对大肠杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度为250 μg/mL和500 μg/mL，对沙门氏菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度为500和1000 μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度为62.5和125 μg/mL。通过实验对比可知大黄酸对大肠杆菌和沙门氏菌具有较强的抑菌效果，大黄素对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌效果。

表3　大黄氯仿萃取物化合物成分Table 3　Chemical composition of chloroform extraction of rhubarb

表4　大黄氯仿组分化合物对3种菌的最小抑菌和杀菌浓度Table 4　The MIC and MBC of five components from chloroform extraction against 3 strains

3　结论

滤纸片实验和96孔板微量稀释实验结果表明大黄提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为6.25、12.5、3.16 mg/mL。对抑菌活性成分进一步分析，用四种不同极性的溶剂对大黄提取物水溶液进行萃取，得到五个萃取部分：石油醚部、三氯甲烷部（氯仿部）、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部。滤纸片实验和96孔板微量稀释实验测定大黄提取物不同萃取部分对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果结果表明：氯仿部对这3种菌的抑制效果最强。氯仿部分经UPLC-MS/MS分析和抑菌实验，追踪到大黄中对大肠杆菌和沙门氏菌抑制作用的有效物质为大黄酸，对金黄色葡萄球菌抑制作用的有效物质为大黄素。

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Antibacterial activities of rhubarb extracts against food-borne bacteria and the bioactive compounds

HOU Yuan-yuan，WU Wen-hui，XU Jian-feng，SONG Yi-shan*
（Colleage of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

In this study，antibacterial activities of rhubarb against E.coli，Salmonella and S.aureus were studied. Preliminery screening indicated that rhubarb root ethanol extract，and the chloroform fraction was found to be the most active fraction of the crude extract.Five major compounds were identified from the chloroform fraction by UPLC-MS/MS，namely emodin，aloe-emodin，rhein，physcion and chysophanol.Among these five compounds，rhein showed the greatest antibacterial activities against E.coli and Salmonella with the MIC as 125 and 250 μg/mL，MBC as 250 and 500 μg/mL.Emodin showed the greatest antibacterial activities against S.aureus. with the MIC and MBC as 62.5 and 125 μg/mL.

rhubarb；antibacterial；E.coli；Salmonella；S.aureus

TS201.3

A

1002-0306（2015）18-0073-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.006

2015－01－06

侯媛媛（1989-），女，硕士研究生，主要从事食品微生物方面的研究，E-mail：hou_yuan_yuan@126.com。

宋益善（1980-），男，讲师，主要从事无机分析化学及食品微生物方面的研究，E-mail：yssong@shou.edu.cn。

国家自然科学基金（81341082）。