不同花色品种蝴蝶兰花色素苷含量分析及相关基因表达研究

许传俊，黄珺梅，黄　雯，曾碧玉

（福建省亚热带植物研究所，福建省亚热带植物生理生化重点实验室，厦门361006）

不同花色品种蝴蝶兰花色素苷含量分析及相关基因表达研究

许传俊*，黄珺梅，黄雯，曾碧玉

（福建省亚热带植物研究所，福建省亚热带植物生理生化重点实验室，厦门361006）

分析红色、黄色、粉紫色和白色蝴蝶兰品种不同开放度的花和叶花色素苷生物合成途径7个结构基因PAL、4CL、CHS、DFR、F3H、F3'5H和ANS基因和3个调节基因的表达.结果显示：10个基因的表达因不同花色、不同发育阶段而异.这10个基因在叶中的表达量相对花较低.黄金甲中PAL、4CL、CHS、F3H、F3'5H基因的表达量均较高，PAL、4CL、CHS和F3'5H在开花期达到峰值，粉色花空港红鹰花DFR、CHS、F3H、F3'5H表达量较高.白色花空港枫叶和黄色花富乐夕阳花中CHS、DFR、F3H、F3'5H和ANS表达量较低.CHS在6个品种花的不同阶段皆有表达.F3H基因在6个品种中表达量较低，与花色素合成不存在直接相关.调节基因bHLH 6个品种各发育阶段的表达量均较高，MYB表达量较低，这些结果表明，蝴蝶兰花色素苷积累是CHS、F3'5H、DFR和ANS等关键结构基因共同表达的结果，编码转录因子bHLH基因的表达可能在花色形成中作用较大.

蝴蝶兰；花色；花色素苷；基因表达

蝴蝶兰（Phalaenopsis）属热带气生兰，多产于亚州热带，其株型美观、花形奇特、色彩艳丽、花期持久，在热带兰中有“兰花皇后”之美称，是兰科植物中栽培最广泛、最普及的种类之一.花色是花卉植物重要观赏性状之一，蝴蝶兰花色主要有白色、红色、黄色和粉色，以及复色等，但缺乏蓝色等新奇花色品种，目前市场上新奇花色品种的培育尤为迫切.花色素成分的分析及催化其合成的关键酶类编码基因表达特性的研究是蝴蝶兰花色定向分子育种的重要前提.花色素是花色形成的基础物质，植物的花色通常是由花色素苷和（或）类胡萝卜素的组合而决定的.兰科植物花色表现出同样的趋势，黄色到橙色由类胡萝卜素决定，橙色到红色由花青素苷和类胡萝卜素组合决定，红色到紫色由花青素苷决定［1］.目前，对拟南芥、玉米等植物开展花色及其相关基因的研究较多，而兰科植物花色相关基因的研究与其他花卉植物相比较为落后［2］.兰科植物花的红色主要来自花色素的糖苷化或者酰基化［3］.对文心兰花色的研究结果表明，文心兰花器官中的红色是由锦葵色素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷等化合物组成，而在黄色的唇瓣中未检测出这些成分［4］.在文心兰唇瓣组织瞬时表达CHI和DFR基因，唇瓣产生红色色素［4］.Su和Hsu［5］利用基因枪法将F3' 5H基因转入蝴蝶兰，转基因的花瓣颜色从粉红色变成紫红色.目前，对于蝴蝶兰花色与相关基因表达之间关系报道较少，本研究以6个不同花色品种的蝴蝶兰为实验材料，检测了花色素结构基因:CHS、DFR、F3H、F3'5 H和 ANS和花色相关转录因子bHLH（basic helix-loop-helix，碱性螺旋 -环 -螺旋）、WD40、MYB在花3个不同开放进程中的表达量，以及与类黄酮合成相关基因PAL和4CL基因在这个过程中的表达变化，并就10个基因在不同花色表达水平进行了比较，分析它们的表达水平与蝴蝶兰花着色的关系.

1　研究方法

1.1材料

蝴蝶兰共6个品种，购自厦门国际航空港花卉科技有限公司，其花色及编号见（表1）.

1.2方法

1.2.1花色素苷含量测定参考按照Weiss等［6］方法进行，在分光光度计下测定提取液在530、657 nm波长下的光密度值OD.利用公式计算每克鲜质量叶片组织花色素苷的相对含量:花色素苷含量OD校=（OD530-1/4 OD657）/g.

表1　蝴蝶兰不同花色品种Table 1　Phanlenopsis cultivars with different flower colors

1.2.2总黄酮含量（TFC）测定采用李崇晖等［7］方法略加改动，以槲皮素3-芸香糖苷（芦丁）做标准曲线.吸取300 μL芦丁溶液或提取液，依次加1 000 μL水和90 μL 50 mg/mL的NaNO2混匀；5 min后加180 μL 100 mg/mL的AlNO3混匀，放置6 min；加600 μL 1 mol/L的NaOH和1000 μL水混匀，静置15 min；测定510 nm处的吸光值；根据标准曲线计算样品中相对于芦丁的总黄酮含量，以mg/g表示，重复3次.

1.2.3qPCR分析花色相关基因表达提取蝴蝶兰不同品种叶片和花不同阶段RNA进行qPCR分析，将花的阶段分为3个时期:花苞小于0.5 cm，花苞大于0.5 cm至开放前，开放的花（图1）.分别编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ.反转录步骤严格按 TaKaRa Prime-ScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒说明进行，反应程序:95℃ 2 min，（95℃ 15 s，58℃20 s，72℃30 s）×40，实验重复3次，引物根据本实验室蝴蝶兰转录组测序结果设计（表2）.

表2　本研究所用引物Table 2　Primers used in real-time PCR

图1　蝴蝶兰花不同发育时期Figure 1　Developmental stages of Phalaenopsis flowers

2　结果和分析

2.1蝴蝶兰不同花色品种花色素苷含量

不同花色品种蝴蝶兰花色素苷含量分析的结果表明，黄色花品种“富乐夕阳”和“黄金甲”的花瓣、唇瓣和叶片内花色素苷含量较低.白色花品种“奇摩白花”花瓣中花色素苷含量最低，红色花和粉红色花“宏霖玫瑰”和“空港红鹰”花瓣花色素苷含量最高，唇瓣内花色素苷含量也较高.白色花“空港枫叶”和“奇摩白花”唇瓣内花色素苷含量与红色花“空港红鹰”没有显著差异，2个白色花品种唇瓣呈现红色特征.红色花“宏霖玫瑰”叶片花色素苷在6个花色品种叶中含量最高.6个品种都是红色唇瓣，除“空港红鹰”外，5个品种唇瓣内花色素苷的含量高于花瓣和叶片（图2）.

图2　蝴蝶兰不同花色品种花色素苷含量Figure 2　Anthocyanin content from different floral color of Phalaenopsis

2.2蝴蝶兰不同花色品种总黄酮含量

除白色花品种“奇摩白花”外，其余5个品种中叶片内总黄酮含量显著高于花瓣和唇瓣的总黄酮含量，“奇摩白花”的叶片总黄酮含量最低，并且与花的唇瓣中总黄酮含量没有显著差异.红花品种“宏霖玫瑰”和“空港红鹰”的花瓣总黄酮含量高于另外4个品种，白花品种“奇摩白花”唇瓣中总黄酮含量较高（图3）.

图3　蝴蝶兰不同花色品种总黄酮含量Figure 3　Flavonoids content from different floral color of Phalaenopsis

2.3蝴蝶兰不同花色品种花色相关基因表达

分析花色相关基因表达发现，7个基因在6个品种的不同阶段花中都有表达，表达量有差异（图4），PAL和4CL在6个品种的花不同阶段都有较高表达，在“黄金甲”花中表达量最高，在“宏霖玫瑰”中最低.4CL在白色花“奇摩白花”的花期1和2中表达量较高，高于另外4个品种.DFR在红花品种“宏霖玫瑰”花蕾期和开花期表达量较高，其中蕾期2表达量在6个品种中最高，白色花“空港枫叶”DFR的表达量较低.F3'5H表达量在“空港红鹰”蕾期1和2中表达量最高，在“黄金甲”和”奇摩白花”的花中表达量次之，F3'5H在红色花“宏霖玫瑰”中的表达量为在6个品种中最低.ANS在“空港枫叶”和“宏霖玫瑰”中表达量较高，在“黄金甲”中表达量最低.而CHS在6个品种中以在“黄金甲”中表达量较高，在开放的花中表达量达到最高，其次为在“空港红鹰”和“宏霖玫瑰”中的表达量，在“奇摩白花”中的表达量较低.F3'H在6个品种中相对其他几个基因表达量较低，其在“黄金甲”中的表达量最高，在白色花中的表达量最低.花色相关基因在6个品种叶片中的表达量总体低于在花中的表达量.

图4　不同花色蝴蝶兰品种花色素苷相关基因表达Figure 4　Expression of anthocyanin synthesis related genes from different floral color of Phalaenopsis

2.4蝴蝶兰不同花色品种花色相关转录因子bHLH、WD40和MYB表达

分析蝴蝶兰花发育不同时期转录因子表达，结果表明，3个转录因子在6个品种的不同阶段都有表达，bHLH在6个品种中表达量总体高于WD40和MYB（图5）.bHLH的表达量在不同品种中表达变化不同，在“奇摩白花”内花中与叶片的表达没有显著差异，在“空港枫叶”中，随花蕾增大，表达逐渐升高，在叶片中检测的表达量最高.在“黄金甲”花蕾1、花和叶中bHLH的表达量相对较高.WD40的表达在不同品种花不同阶段表达不同，表达量相对低于bHLH的表达量，在“黄金甲”幼小花蕾中表达量最高，在“奇摩白花”蕾期2中表达量次之，转录因子MYB的表达在几个品种中表达变化基本一致，随花蕾生长到开放表达量逐渐降低，而在叶片中表达量较高.

图5　蝴蝶兰不同花色品种花色相关转录因子表达Figure 5　Expression of transcription factors involved in anthocyanin synthesis from different floral color of Phalaenopsis

3　讨论

3.1不同花色品种中结构基因的表达差异

花色素的合成由一系列花色素结构基因和调节基因调控，其中结构基因的表达与花色素积累直接相关［8］.已知查耳酮合成酶（CHS）是花色素合成途径上关键的基因之一，它的表达与否与花色的形成密切相关.CHS基因在花器官的各部位和红色的幼叶均有表达［9-11］.文心兰CHS失活导致花器官不能积累花色素苷［12］.本研究结果表明，CHS虽在6个蝴蝶兰花色品种中皆表达，但在黄色带红色条纹的蝴蝶兰品种“黄金甲”和红色花品种花中表达量较高，而在白色花品种与黄色花品种中表达量较低，可见CHS是在蝴蝶兰花色素形成中有重要作用.

DFR是红色着色所必须的结构基因，红色紫苏叶片和苹果红色果皮中 DFR表达产物大量积累［13-14］.DFR基因是黄皮洋葱和拟南芥中花青素合成的“瓶颈”基因［15-16］.菊花黄色品种DFR表达量远低于红色与粉紫色品种，推断DFR基因很可能是菊花花青素合成的关键基因［17］.本研究也证实黄色花品种和白色花品种DFR基因表达量较低，黄色花品种的花色素苷含量也低于另外4个花色品种. Wang等［18］在对大花蕙兰花色研究中发现，DFR和ANS只在花色素苷积累的组织中表达，Han等［9］和Wang等［19］指出CHS、F3'5H在蝴蝶兰红色花中高表达，在白色花和黄色花中也有表达.Chen等［2］研究发现CHS和ANS在蝴蝶兰白色花和红色花中表达没有显著差异，而本研究表明，CHS、F3'5H、DFR、ANS在不同的花色中表达显著差异，在白色品种花中DFR、F3'H、F3'5H、CHS等基因表达量较低，低表达水平的花色素结构基因很可能影响了花色素的合成，从而使其花色素含量较低而使花瓣呈现白色.在菊花白色突变体中参与花青素苷合成的关键结构基因的表达都有所下调，DFR基因不表达，F3H和ANS的表达明显下调.这说明DFR、F3H和ANS的下调表达可能是导致舌状花无法积累花青素苷的主要原因［20］.F3H在6个品种中都表达量较低，可能与蝴蝶兰花色形成关系不密切，陈素梅等［17］也认为F3H可能不是菊花花色素合成的关键基因.

3.2不同花色品种中调节基因的表达差异

花色苷生物合成途径的基因调控主要发生在转录水平上，与花色苷合成有直接关系的转录因子有bHLH蛋白、MYB蛋白和WD40重复蛋白3种［21］.MYB-bHLH复合物或者3类转录因子相互作用形成MYB-bHLH-WD40复合物（MBW复合物）调节花色素合成的［22］.Griesbach and Klein［23］认为蝴蝶兰花色素苷的生物合成需要Myc Lc和Myb C1两种转录因子，缺乏MYB基因表达致使白花蝴蝶兰丧失DFR活性，花中不能合成花色素苷，而在紫色的蝴蝶兰中却可以检测到高表达的 MYB和 DFR基因［24］.我们发现白色花品种“空港枫叶”和黄色花品种“富乐夕阳”的MYB表达量较低，DFR基因的表达量也较低，花中花色素苷含量也较低.蝴蝶兰bHLH表达量在6个品种中相对高于WD40和MYB. bHLH转录因子，调节类黄酮和花色素合成是植物bHLH转录因子最重要功能之一.MYB和bHLH在菊花白花突变体表达量低可能是突变体花色缺失的重要因素［13］.蝴蝶兰6个花色品种中bHLH表达量较高可能与其与蝴蝶兰花色形成密切相关.

通过转基因技术，有目的地过表达一些外源的花色素合成相关基因或转录因子，或者使内源基因下调，获得了花色改良的花卉品种.如:转基因矮牵牛、月季等［25-26］.烟草过表达ANS基因产生粉色或白色的花，并且花色素苷含量也下降［27］.抑制红色花蝴蝶兰中花色素合成途径中UFGT表达产生白色花瓣的蝴蝶兰［2］.烟草过表达MYB基因上调了CHS，CHI，UFGT和FLS基因的表达，花中积累比野生型更高水平的花色素和黄酮醇［23］.利用基因枪法向文心兰黄色唇瓣组织中转化OgMYB1可重新生成红色色素［4］.多数兰科植物缺乏红色、蓝色和紫色，兰花缺乏红色系和紫色系是结构基因和转录因子共同作用的结果［1］.对蝴蝶兰花色素苷合成相关基因表达进行分析，以利更深入地分析基因表达模式与蝴蝶兰花色形成的关系，为进一步认识蝴蝶兰花色呈色机理奠定基础.

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【中文责编：成文英文责编：李海航】

Studies on the Anthocyanin Content and Related Gene Expression in Different Floral Colours Cultivars of Phalaenopsis

Xu Chuanjun*，Huang Junmei，Huang Wen，Zeng Biyu
（Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plant，Fujian Institute of Subtropical Botany，Xiamen 316006，China）

In order to clarify the roles of anthocyanin biosynthetic genes in the anthocyanin biosynthesis and pigmentation of Phalaenopsis flower，the expression of 7 structural genes PAL，4CL，CHS，DFR，F3H，F3'5H，ANS and 3 regulating genes were quantified at different developmental stages in the red，yellow and white flowered Phalaenopsis cultivars.The results showed that expression profiles of the 10 genes are cultivar dependent and varied at different developmental stages.All 10 gene transcripts are lower in leaves compared to flower.In“Huangjinjia”，the expressions of four genes PAL、4CL、CHS，F3H and F3'5H are high and reach the peak at the stageⅢ.In“Kongganghongyin”，DFR，CHS，F3H，F3'5H expressed high at the stageⅢ.While in“Fulexiyang”and“Konggangfengye”，CHS，DFR，F3H，F3'5H and ANS expressed low in three stages compared to another 4 cultivars.F3H transcript level was the lowest among the 10 genes studied in the 6 cultivars.CHS transcript was detected in all stage of flower in 6 cultivars.The low expression of F3H gene in the 6 varieties indicates that there is no direct correlation between anthocyanin synthesis and F3H.The expression of bHLH was high in the 6 cultivars of different developmental stages，while the accumulation of MYB transcript was very low in 6 cultivar.These results indicated that the expression of CHS，DFR，F3'5H and ANS genes are necessary in Phalaenopsis anthocyanin biosynthesis.The transcription factor bHLH expression may have greater impact on Phalaenopsis flower color formation.

Phalaenopsis；floral color；anthocyanin；expression of genes

Q786，S682.31

A

1000-5463（2015）03-0093-07

2014-11-10《华南师范大学学报（自然科学版）》网址:http://journal.scnu.edu.cn/n

国家自然科学基金项目（31070618）

许传俊，副研究员，Email:xcj8899@126.com.