溴代苯甲酰胺类拮抗剂的合成、表征及生物拮抗活性分析

程德军，黄　斌，李明田，张付宝

（1.四川理工学院材料与化学工程学院，自贡643000；2.中昊晨光化工研究院有限公司，富顺643002）

溴代苯甲酰胺类拮抗剂的合成、表征及生物拮抗活性分析

程德军1*，黄斌1，李明田1，张付宝2

（1.四川理工学院材料与化学工程学院，自贡643000；2.中昊晨光化工研究院有限公司，富顺643002）

非肽类小分子拮抗剂可以作为一种靶向制剂，用于防治人类HIV-1感染.溴代苯甲酰胺类非肽类小分子具有酰胺、哌啶、卤原子等活性基团而备受关注.该文合成了苯甲酰胺的邻位、间位以及邻位间位二取代溴化物中间体7，以对氯苄氯为原料合成了4-溴-2-溴甲基-1-（（4-氯苄基）氧）苯（中间体3），通过中间体3、中间体7合成了3种新的溴代苯甲酰胺类拮抗剂8a-8c，对3种溴代物进行了1H NMR、IR、MS表征及生物活性检测.结果表明，N-烯丙基-N-（1-（5-溴-2-（4-氯苄氧基）苄基）-4-哌啶基）-2，5-二溴苯甲酰胺具有一定的生物活性.

苯甲酰胺；合成；结构表征；生物活性

结构正常的辅助受体CCR5是HIV进入人体白细胞的辅助受体，通过阻断CCR与HIV病毒的作用可阻止病毒侵入与复制，特定的突变基因型CCR5具有抗HIV感染的能力，因此，CCR5成为开发抗HIV药物的新靶点，以防治人类HIV感染［1-4］.目前，辅助受体CCR5的拮抗剂主要为非肽类小分子化合物.日本Takeda公司研发了TAK-779非肽类小分子拮抗剂，该类突变基因型CCR5拮抗剂具有抗HIV感染的能力［5］.针对辅助受体CCR5的非肽类小分子拮抗剂已受到相当的关注.

本文基于非肽类小分子化合物的结构特点，以哌啶环和苯甲酰胺为基础结构［6］，并在该结构上逐步引入活性溴原子，通过保护氨基法，逐步酰胺化得到3种溴代苯甲酰胺中间产物；通过NBS溴化得4-溴-2-溴甲基-1-（4-溴苄氧基）苯，最后通过氨基与溴代物消去，合成了3种新的非肽类小分子化合物，合成步骤相对较少，反应条件温和，合成总产率较高，并且比生产小分子蛋白成本低，其结构经1H NMR、IR及MS确证［7］.同时，对目标产物8a-8c进行了生物活性测试和讨论，以研究不同位置溴代产物对苯甲酰胺类小分子化合物生物活性的影响.实验路线见图1.

图1　N-烯丙基-N-（1-（5-溴-2-（4-氯苄氧基）苄基）-4-哌啶基）-2，5-二溴苯甲酰胺8a-8c的合成路线Figure 1　Synthetic route of N-allyl-2，5-dibromo-N-（1-（5-bromo-2-（（4-chlorobenzyl）oxy）benzyl）piperidin-4-yl）benzamide 8a-8c

1　实验部分

1.1主要试剂与仪器

二甲基甲酰胺（DMF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、N-溴代丁二酰亚胺（NBS）、1-羟基苯并三唑（HOBT）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDCI）、二碳酸二叔丁酯（（Boc）2O）、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、三乙酰氧基硼氢化钠（STAB）、四氢呋喃（THF）、4-氯苄氯、5-溴水杨醛、1-苄基-4-哌啶酮、烯丙胺盐酸盐、2，5-二溴苯甲酸、丙酮、二氯甲烷、甲醇、三氟乙酸，硼氢化钠、碳酸钾，以上药品均为分析纯.［35S］GTPγS（1 200 Ci/mmol），GDP、GTPγS购自Sigma，CHO-K1细胞购自ATCC，DuPont-NewEngland Nuelear公司.

核磁共振波谱仪（Bruker AV600 600 MHz德国），质谱仪（AGILENT MSD VL美国），傅立叶变换红外光谱仪（TENSOR27德国）.

1.2合成方法

为解决小分子抑制剂只能作用于CCR5的单个位点，以增加CCR5小分子拮抗剂的位点结合性，本文设计的3种溴代拮抗剂增加了产物的生物活性:设计与酰胺相连的活性杂原子取代苯环；含有活性季氮原子的哌啶环；引入了活性的溴和氯原子；产物的中间结构是有生物活性的环状结构的哌啶.这些结构的设计都能增加产物的生物活性.

根据合成设计思路，中间体7以1-苄基-4-哌啶酮为原料，为避免酰化对氨基影响，通过N原子保护后酰化得到；中间体3以5-溴水杨醛、4-氯苄氯为原料，通过消去、还原及溴化合成；最后通过中间体7、中间体3氨基化合成了3种新的溴代苯甲酰胺类拮抗剂8a-8c.现以N-烯丙基-N-（1-（5-溴-2-（4-氯苄氧基）苄基）-4-哌啶基）-2，5-二溴苯甲酰胺为例说明合成过程.

1.2.14-溴-2-溴甲基-1-（4-氯苄氧基）苯（3）的合成中间体3的合成以4-氯苄氯4.86 g（30 mmol）、5-溴-水杨醛5.00 g（25 mmol）为原料，参考文献［8］方法，合成路线如图2，通过NBS溴化等最终合成了中间体4-溴-2-溴甲基-1-（4-溴苄氧基）苯，8.80 g，产率98.7%.对产物做1H NMR、MS及IR结构表征.

1.2.21-N-Boc-4-烯丙胺哌啶（5）的合成中间体5的合成以4-哌啶酮盐酸盐15.28 g（0.1 mol）和22.92 g（0.11 mol）（Boc）2O为原料，参考文献［9］方法，合成路线如图2，合成了N-叔丁氧羰基-4-哌啶酮19.77 g产率99.2%，然后加入烯丙基氨，合成了1-N-Boc-4-烯丙胺哌啶4.70 g，产率78.2%.

图2　4-溴-2-溴甲基-1-（4-氯苄氧基）苯的合成路线Figure 2　Synthetic route of 4-bromo-2-（bromomethyl）-1-（（4-chlorobenzyl）oxy）benzene

图3　1-N-Boc-4-烯丙胺哌啶的合成路线Figure 3　Synthetic route of tert-butyl 4-（allylamino）piperidine-1-carboxylate

1.2.32，5-二溴-N-烯丙基-N-（4-（N-Boc）哌啶基）苯甲酰胺（6）的合成100 mL三口烧瓶加入2，5-二溴苯甲酸1.68 g（6.0 mmol）、0.52 g HOBT和CH2Cl220 mL，室温下搅拌30 min，加入中间体（5）1.20 g（5 mmol）及EDCI 0.75 g，搅拌并做TLC检测，无原料后结束反应.用水与CH2Cl2分液，有机相用饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，最后浓缩，柱层析分离后蒸干，得黄色油状物（6）2.06 g，产率82.1%.

1.2.42，5-二溴-N-烯丙基-N-（4-哌啶基）苯甲酰胺（7）的合成取中间体（6）1.00 g（2 mmol）溶于10.0 mL二氯甲烷中，滴入1.00 mL的三氟乙酸，室温下搅拌，TLC板检测反应，完成后蒸干溶剂，加入10.0 mL二氯甲烷，旋蒸干，以带出多余的三氟乙酸，50 mL乙酸乙酯溶解，过滤，饱和食盐水洗涤2次，无水Na2SO4干燥，蒸干得油状化合物7（0.58 g），产率73.5%，对产物做1H NMR、MS及IR结构表征.

1.2.5N-烯丙基-N-（1-（5-溴-2-（4-氯苄氧基）苄基）-4-哌啶基）-2，5-二溴苯甲酰胺（8）的合成50 mL单口瓶中加入中间体3 0.40 g（1 mmol）、化合物7 0.40 g（1 mmol）、碳酸钾0.17 g（1.2 mmol）及溶剂DMF 10 mL，于室温搅拌下反应2～5 h，TLC检测无原料后结束反应，将反应液倒入约50 mL水中，摇匀，水溶液再用100 mL乙酸乙酯分2次萃取，合并有机相，饱和食盐水洗3次，无水Na2SO4干燥，浓缩后过柱分离，得0.45 g白色固体8a，产率61.7%，对产物做1H NMR、MS及IR结构表征.8b和8c以同样的方法合成.

1.3产物的结构表征

用核磁共振氢谱（1H NMR）在600 MHz下，以CDCl3为溶剂，测定2种主要中间体和3种产物的化学位移值；在4 000～400 cm-1下用红外光谱（IR）测定3种产物的透过率；用质谱（MS）法测定2种主要中间体和3种产物的分子离子峰，以表征目标产物的结构.

1.4受体拮抗剂的GTPγS活性检测

将离心收集的CHO-K1细胞悬于裂解缓冲液（5 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EGTA，5 mmol/L EDTA，pH 7.5）中，用胰岛素针筒抽8次，离心抽取上层溶液，沉淀悬于反应缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH 7.5）中，缓冲液中加入40 mmol/L GDP、8 nmol/L［35S］GTPγS溶液，不同浓度的TSC在30℃下温育后加入1 μL 8的3种取代产物及已报道药物TD 0232［10］，37℃反应1 h，用PBS终止反应，在解压下用玻璃纤维滤膜抽滤，液闪计数（c.p.m）.样品的本底激活量（Basal）为在反应系统中不加3种样品（sample），非特异性结合（NSB）为在反应系统中加入10 mmol/L的GTPγS，计算［35S］GTPγS结合百分比（IC50）.

2　结果与分析

2.1溴代苯甲酰胺类产物的产量与产率

中间体3和中间体7反应得到了产物8，同时通过相同的合成路线合成了邻位、间位及邻间二溴代化合物，3种溴代物都是白色固体，总产率较高（表1），主要原因是合成步骤相对少，反应条件温和.其中一溴代化物产量略高于二溴代物，说明取代基的增多，影响了产物的产率.

2.23种溴代物8a-8c的表征分析

对比3种溴代物的MS数据（表2），A、B有相同的分子离子峰，可以区分C-邻间位溴代与A-间位溴代和B-邻位溴代；通过1H NMR数据，在化学位移值6.0以前有几乎相同的结构，受苯环上羰基及取代溴的影响，A和C的29位上的氢峰出现在8.20附近，耦合常数显示其有间位氢，可区分C-邻间位溴代8c和A-间位溴代8a与B-邻位溴代物8b.

表1　3种溴代苯甲酰胺类产物的产率Table1　Status and productive rates of three kinds of bromo benzamides

表2　3种溴代苯甲酰胺类产物的1H NMR、MS及IR数据Table 2　1H NMR，MS and IR data of three kinds of bromo benzamides

2.33种溴代物8a-8c的［35S］GTPγS活性测试

对合成的3种目标产物做［35S］GTPγS结合实验初筛，化合物的结合百分比用Sigmaplot8.0软件处理，结果见表3.

表3　3种溴代苯甲酰胺类产物的IC50Table 3　IC50data of three kinds of bromo benzamides nmol/L

计算得到TD0232的IC50值为3.1±0.6 nmol/L，与文献报道［11-12］相近.3种产物与TD0232的抑制率大于50%，8c的IC50值高于8a和8b，其拮抗活性（5.68±0.3 nmol/L）比报道的化合物TD0232的拮抗活性稍低，但相差不大，可以作为进行药物开发的候选化合物.

3　结论

本文采用相同的路线分别合成了中间体3和中间体7，通过2个中间体分别合成了邻位、间位及邻间二取代溴代苯甲酰胺类拮抗剂，其中，邻间二取代物总产率23.4%.相对其他拮抗剂，合成步骤相对较少，反应条件要求不高.其结构经1H NMR、IR及MS确证.

由于二溴取代物有较好的活性，且是一个具有绝对构型的单一异构体，选择该化合物N-烯丙基-N-（1-（5-溴-2-（4-氯苄氧基）苄基）-4-哌啶基）-2，5-二溴苯甲酰胺作为进行药物开发的候选化合物.

目前，国际上针对非肽类小分子化合物CCR5抑制剂的研究倍受关注，这类小分子拮抗剂不具有潜在的炎症应答效应，可能在抗HIV感染或生物医药领域内具有潜在的应用价值，可通过静脉注射方式给药的优势，具有广泛的应用前景.

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【中文责编：成文英文责编：李海航】

Synthesis，Characterization and Biological Antagonistic Activity of Bromo Benzamides CCR5 Antagonists

Cheng Dejun1*，Huang Bin1，Li Mingtian1，Zhang Fubao2
（1.College of Materials and Chemical Engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，China；2.Zhonghao Chenguang Research Institute of Chemical Industry Co.Ltd.，Fushun 643002，China）

The non-peptide small molecular antagonists can be used as a targeting preparation in the prevention of human HIV-1 infection.Interest in the bromo benzamides has been increasing due to their active groups such as amide，pyridine and halogen atom.In this paper，the intermediates 7（ortho substituted benzamides，meta substituted benzamides and ortho meta position two substituted benzamides）were synthesized，and 4-bromo-2-（bromomethyl）-1-（（4-chlorobenzyl）oxy）benzene（intermediate 3）was synthesized from 1-chloro-4-（chloromethyl）benzene.Three bromo benzamide antagonists were synthesized by the reaction of intermediate 3 with intermediate 7. These compounds were characterized by1H NMR，IR，MS and biological activity.The results show that the N-allyl-2，5-dibromo-N-（1-（5-bromo-2-（（4-chlorobenzyl）oxy）benzyl）piperidin-4-yl）benzamide has a certain biological activity.

benzamides；synthesis；structure characterization；biological activity

O621.3

A

1000-5463（2015）03-0069-05

2014-07-03《华南师范大学学报（自然科学版）》网址:http://journal.scnu.edu.cn/n

国家自然科学基金项目（51303115）；四川省教育厅2015年度科研计划项目（15ZB0215）；自贡市重点科技计划项目（2014ZC01）.

程德军，讲师，Email:80131515@163.com.