DHPLC和PCR－RFLP技术筛查下肢静脉血栓患者EPCR多态基因*

孙新六 阴冠程

(泰山医学院附属泰山医院，山东泰安 271000)

静脉血栓形成是血液在静脉内非正常凝结而导致静脉回流障碍的一种疾病，易发于下肢静脉。静脉血栓的主要症状为肢体肿胀和疼痛，血栓脱落易形成肺栓塞，危及病人生命[1]。研究表明特定基因突变易导致凝血机制异常而形成静脉血栓[2]，本文探讨以变性高效液相色谱技术(dHPLC)和限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR－RFLP)检测下肢静脉血栓患者内皮细胞蛋白C受体基因(EPC)6936位点分布状态，探讨其与下肢静脉血栓形成的关系。。

1 材料与方法

1.1 研究对象

病例组:2011年1月至2013年5月在山东泰安市中心医院心血管外科诊疗的下肢静脉血栓患者75例。其中男性43例，女性32例，年龄33～80(47.2±9.3)岁，所有病例经彩超检查均患有下肢静脉血栓。另选择同时期健康查体者65人，男性37人，女性28人，年龄45.1±8.6岁(31～76岁)，做为对照组。所有研究对象均排除恶性肿瘤、自身免疫性疾病、血液系统疾病以及血栓性疾病家族史。

1.2 主要试剂

PCR扩增试剂盒和限制性内切酶AluI均购于大连宝生物公司;

1.3 引物设计

从Genebank数据库检索内皮细胞蛋白C受体基因6936位点的核苷酸序列，用Primer5.0设计扩增引物，并BLAST其扩增特异性。

上游引物:5＇－CCTATTCTTCGGGCTAACTCT －3＇

下游引物:5＇－CACACCAGCAATGATGAAGC －3＇

EPCR各基因型的PCR产物经AluI酶切后预计片段长度:GG型:150bp;AA基因型:111bp，39bp两片段 ;AG基因型:150bp，111bp，39bp三片断。

1.4 基因DNA提取

研究对象均抽取静脉血3ml，以枸橼酸钠抗凝。以淋巴细胞分离液分离单个核细胞，以含蛋白酶K的细胞裂解液消化裂解细胞，以苯酚氯仿抽提纯化DNA，DNA 终液调至 100 ng/μl。

1.5 PCR扩增反应

反应体系 50 μl，DNA 样品取 1 μl，每个引物终浓度1.0 μM，MgCl2终浓度 2.0 μM，dNTP 为 0.2 μM，每管加1.0U Taq DNA聚合酶。反应条件:94℃，5 min预变性;30个循环:94℃，40 s变性;57℃，40 s复性;72℃，1 min延伸;最后72℃充分延伸10 min。扩增产物取5 μl以3.0%琼脂糖凝胶电泳，扫描凝胶成像，如出现150 bp单条亮带则为扩增阳性。

1.6 变性高效液相色谱分析

PCR 产物取10 μl，94 ℃变性2 min，以 －1 ℃ /S缓慢复性，温度从94℃降 至40℃，形成同源或异源体DNA，将此样品上岛津高效液相色谱仪检测，以乙腈梯度洗脱，从洗脱曲线判定基因型别，同时以未加DNA底物的空白对照扩增液上色谱柱做为阴性对照。

1.7 酶切分析

取DHPLC中峰型典型样品扩增产物经琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化后进行酶切鉴定，取5μl纯化的扩增产物，10×酶切缓冲液2 μl，限制性内切酶 AluI 1 μl，另加三蒸水至总反应体系 20 μl，37℃水浴酶切反应2 h。酶切产物以3%琼脂糖凝胶电泳，在Alpha凝胶图像分析仪上扫描凝胶成像。

1.8 sEPCR测定

应用双抗体夹心ELISA法测可溶性血管内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)水平。以sEPCR液预先包被好微孔，取实验样品和系列稀释标准品分别加孔，再与HRP标记的sEPCR抗体结合，形成抗体－抗原－酶标抗体复合物，经过漂洗后加底物TMB显色，颜色的深浅和样品中的sEPCR呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人可溶性血管内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)浓度。

1.9 统计分析

以Stata 11.0统计软件进行分析。sELISA浓度计量数据以xˉ±s表示，两样本均数比较进行t检验，多样本均数比较进行方差分析。各基因型及等位基因频率比较进行卡方检验，以OR和95%CI表示基因型和等位基因的相对危险度。以P＜0.05定义为差异显著有统计学意义。

2 结果

2.1 变性液相色谱分析

变性后DNA上色谱柱经乙腈梯度洗脱，空白扩增液洗脱曲线为单个峰，为引物峰;AA基因型和GG基因型均为两个峰，一个为引物峰，另一个为A基因型峰或G基因型峰;杂合AG基因型呈现三个峰:引物峰、AA基因型峰和GG基因型峰(如图1)。

图1 变性高效液相色谱分析EPCR基因型

2.2 酶切分析 纯化的PCR扩增产物经AluI内切酶消化后凝胶电泳，GG基因型呈现150bp条带;AA基因型呈现111bp和39bp两条条带;AG基因型呈现150bp、111bp和39bp三条条带(如图2)。

图2 EPCR多态性限制性内切酶电泳图

2.3 EPCR基因型 EPCR的基因在6936位置共有三种基因型:AA，AG和GG基因型，基因型和等位基因分布见表1。病例组和正常对照组EPCR基因型及等位基因分布符合Hardy－Weinberg遗传平衡检验定律。AA，AG和GG基因型分布在两组中经卡方检验(χ2=8.381，P=0.015＜0.05)统计学差异显著;等位基因A和a在两组中分布经卡方检验(χ2=10.341，P=0.001＜0.01)统计学差异显著，在下肢静脉血栓实验组，AG和GG基因型分布频率高，等位基因G分布频率高。

表1 EPCR6936基因型及等位基因分布

2.4 外周血sEPCR水平

各基因型外周血浆中可溶性血管内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)水平不同(表2)，与AA基因型相比较，下肢静脉血栓组 AG基因型 sEPCR浓度为152.6±25.3 ng/ml，GG基因型 sEPCR浓度为145.7±39.3 ng/ml，AG与GG基因型sEPCR水平均有统计学显著差异(P＜0.05和P＜0.01)。

表2 不同基因型中血浆sEPCR水平(ng/ml)

2.5 EPCR基因多态性与下肢静脉血栓风险

血管内皮细胞蛋白C受体6936位点基因型与下肢静脉血栓发生的风险相关，与AA基因型比较，AG基因型下肢静脉血栓相对风险为2.822(1.284－6.203)，GG基因型下肢静脉血栓相对风险4.837(0.470－8.948)(见表3)，AG型和GG型相对风险均差异显著(P＜0.05)，表明两基因型与下肢静脉的发生呈现相对高的风险。

表3 EPCR基因多态性与下肢静脉血栓风险

3 讨论

下肢静脉血栓是常见的一种疾病，与年龄、职业、吸烟和遗传相关[3]，下肢静脉血栓引发下肢酸胀等局部症状，如血栓脱落容易导致肺栓塞危及生命，针对易诱发下肢静脉血栓高危人群进行提前干预非常必要。

蛋白C(PC)系统具有重要的抗凝血机制，内皮细胞活化蛋白C受体(EPCR)主要表达在大血管的内皮细胞膜上，PC与EPCR的结合可活化PC系统达到抗凝功能[4]。

本研究探讨与下肢静脉血栓风险相关的血管内皮细胞蛋白C受体6936位点的多态性，并以变性高效液相色谱技术(dHPLC)和限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR－RFLP)两种方法结合筛查血管内皮细胞蛋白C受体(EPCR)的多态性基因。

内皮细胞活化蛋白C受体(EPCR)，是一种维生素K依赖的跨膜蛋白，参与激活蛋白C系统。EPCR 6936位点A/G突变使第219位丝氨酸转变为甘氨基酸[5]，使 EPCR构象改变，失去稳定性，易为蛋白酶剪切进而从内皮细胞膜上脱落，失去抗凝功能，并使血浆中可溶性的EPCR(sEPCR)增加[6]。

我们研究了75名下肢静脉血栓患者和65名正常健康者EPCR基因6936位点的基因，结果显示:EPCR具有AA、AG和GG 3种基因型，在病例组其频率分别为57.3%、37.3%和5.3%，与正常对照组比较，AG和GG基因型分布频率高，差异显著.下肢静脉血栓病例组的突变纯合子(GG)与突变杂合子(AG)的总频率为42.6%。突变等位基因(G)频率为24.0%，均显著高于对照组，显示G等位基因与下肢静脉血栓发生相关。

血浆中可溶性EPCR(sEPCR)在各基因型中水平不同，病例组GG型血浆sEPCR水平178.7±43.7ng/ml，显著高于对照组GG型，表明突变等位基因G与sEPCR水平升高有显著关联。

EPCR 6936位点基因突变能够增加下肢静脉血栓的风险，此基因突变频率呈现种族、地区差异[7]。EPCR作为重要的抗凝机制－蛋白C系统的主要成员，对其基因研究得以关注。

由于研究多态基因需检测大量标本，许多SNP没有酶切位点不适用酶切，单链构型多态性分析耗时长，测序方法成本较高。我们首先采用变性高效液相色谱技术(dHPLC)，从大量标本中快速筛查出基因型，然后采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR－RFLP)精确确定基因型。DHPLC技术能在很短时间内检测大量标本，但准确度欠佳，PCR－RFLP虽能精确检测基因型，但耗时长，两种技术的结合，能在较短时间内实现对大样标本多态基因的检测，使对大量群体基因筛查成为可能。EPCR多态基因筛查，使下肢静脉血栓高危人群能提前干预，以药物、生活方式和饮食习惯调节，避免下肢静脉血栓的发生。

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