益气化瘀方对缺血-再灌注大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响*

林凯旋　安辉　缪灿铭　黄国强　刁建新

（1.广州中医药大学中山附属医院，广东中山528400；2.南方医科大学动物实验中心，广东广州510000）

益气化瘀方对缺血-再灌注大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响*

林凯旋1安辉1缪灿铭1黄国强1刁建新2

（1.广州中医药大学中山附属医院，广东中山528400；2.南方医科大学动物实验中心，广东广州510000）

目的观察益气化瘀方对缺血-再灌注（I/R）大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Fas及P53表达的影响。方法采用结扎左冠状动脉前降支，心肌缺血30 min，再灌注2、4 h制作缺血-再灌注模型。将大鼠随机分为7组，即假手术组、模型2 h组（缺血-再灌注2 h）、模型4 h组（缺血-再灌注4 h组）、通心络2 h组（缺血-再灌注2 h）、通心络4 h组（缺血-再灌注4 h）、益气化瘀方2 h组（缺血-再灌注2 h）、益气化瘀方4 h组（缺血-再灌注4 h）。造模前连续灌胃相应药物1周。免疫组化法测定Bcl-2、Bax、Caspase-3、Fas、P53蛋白表达。结果益气化瘀方可提高缺血-再灌注大鼠心肌Bcl-2蛋白表达量（P＜0.05）、降低缺血-再灌注大鼠心肌Bax、Caspase-3、Fas、P53蛋白表达量（P＜0.05）。结论益气化瘀方可减轻大鼠心肌缺血-再灌注细胞凋亡，其机理可能与上调Bcl-2蛋白表达和下调Bax、Caspase-3、fas、P53蛋白表达有关。

缺血-再灌注损伤心肌细胞凋亡益气化瘀方Bcl-2蛋白Bax蛋白Caspase-3蛋白fas蛋白P53蛋白

近年来，细胞凋亡的研究改变了人们对许多心血管疾病的认识。既往认为心肌缺血、缺血/再灌损伤造成的心肌细胞死亡形式是细胞坏死。近年研究证明［1］，氧化应激、负荷过重、缺血、缺氧、再灌注损伤等不仅引起心肌细胞坏死，还可诱导心肌细胞凋亡。细胞凋亡是受一系列程序控制并通过信号通路介导的病理过程，阻断其信号通路将有助于阻断凋亡发生，防止心肌细胞数目的减少，维持或改善心功能［2］。笔者通过多年的临床观察发现：益气化瘀方能减少急性心肌梗死冠状动脉介入手术（PCI）后再灌注损伤。为明确其机理，本研究应用大鼠实验性心肌缺血再灌注模型，采用免疫组化法对心肌凋亡相应调控蛋白进行观察，为防治心肌缺血/再灌损伤从而促进心肌细胞功能恢复提供实验依据。

1　材料与方法

1.1动物健康雄性SD大鼠（鼠龄3个月左右）42只，体质量（220±20）g，购自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SXCK粤2011-0015。

1.2试剂与仪器益气化瘀方：中山市中医院制剂室制造，批号：粤20130227。通心络胶囊：石家庄以岭药业，批号：120404。细胞凋亡原位检测试剂盒（POD）购自Roche公司，SP试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3分组与给药将42只SD大鼠随机分为7组：假手术组、模型2 h组（30 min心肌缺血后再灌注2 h）、模型4 h组（30 min心肌缺血后再灌注4 h）、通心络2 h组（30 min心肌缺血后再灌注2 h）、通心络4 h组（30 min心肌缺血后再灌注4 h）、益气化瘀方2 h组（30 min心肌缺血后再灌注2 h）、益气化瘀方4 h组（30 min心肌缺血后再灌注4 h），每组6只。各组大鼠于造模前1周开始灌胃给药，连续7 d。益气化瘀方组予益气化瘀方1.8 mL［生药含量7.2 g/（kg·d）］，通心络组予通心络药粉兑入0.9%氯化钠注射液溶液1.8 mL［生药含量0.142 g/（kg·d）］，其余3组予等量0.9%氯化钠注射液。

1.4模型制备10%乌拉坦腹腔注射麻醉（1 mL/100 g）大鼠，仰卧位固定，用针型电极插入大鼠四肢皮下记录标准肢体Ⅱ导联心电图。于胸骨左缘3～4肋间切开胸壁，暴露心脏，在左心耳与肺动脉于之间结扎左冠状动脉前降支，同时在结扎线与血管之间穿一直径2 mm，长5 mm的硅胶管，结扎30 min；然后剪断缝合线，取出硅胶管，各组分别再灌注2 h或再灌注4 h，以往已有实验证实此缺血再灌注时间足以引起心肌细胞凋亡。假手术组仅分离前降支，但不结扎。

1.5标本采集及检测1）心肌细胞凋亡率检测。石蜡包埋心肌组织，采用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测。结果根据凋亡阳性细胞分布情况，每张切片拍摄10个阳性视野，每视野记数30个心肌细胞中阳性细胞数，以平均计算阳性细胞所占的百分比作为细胞凋亡率（AR）。2）Bcl-2、Bax、Caspase-3、Fas、P53蛋白表达检测。取上述石蜡标本相应部位的连续切片各5张，采用过氧化物酶标记的链霉卵白素（SP）法进行免疫组化染色和DAB显色法。每张切片于阳性表达区域选择10个无重叠视野，用图像分析仪进行分析，并计算其光密度值的均值。

1.6统计学处理应用SPSS13统计软件处理。计量资料以（±s）表示，使用方差分析方法计算平均值，并且进行多重分析。如果方差齐，平均值是通过方差分析，个体差异有意义，再进行多重分析。如果方差不齐，平均值是用Welch的检验，他们的个体差异由Games-Howell的分析。多组比较采用方差。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组心肌细胞凋亡情况比较见表1。经TUNEL染色及苏木精复染后凋亡细胞核呈棕色，正常细胞核染蓝色。假手术组缺血-再灌注2 h后仅见极少数散在的凋亡细胞，模型组凋亡细胞数与假手术组相比明显增加（P＜0.05），随着再灌注时间延长细胞凋亡数显著增加（P＜0.05）。益气化瘀方组及通心络组凋亡细胞数较相同灌注时间的模型组显著下降（P＜0.05）。

表1　各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较（±s）

表1　各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较（±s）

与假手术组比较，△P＜0.05；与模型2 h组比较，*P＜0.05；与模型4 h组比较，#P＜0.05。下同。

组别n剂量［g/（kg·d）］细胞凋亡率（%）假手术组100.081.00±0.40*#模型2 h组100.0826.50±2.80△#模型4 h组100.0840.20±2.90△*通心络2 h组100.1414.10±1.00△*#通心络4 h组100.1416.70±2.20△*#益气化瘀方2 h组107.2012.20±1.90△*#益气化瘀方4 h组107.2020.30±5.36△#

2.2各组心肌细胞Bcl-2表达的比较见表2。假手术组见较多的Bcl-2蛋白阳性染色胞质。模型组2 h及4 h的Bcl-2蛋白表达显著减少（P＜0.05），通心络组和益气化瘀方组2 h及4 h后Bcl-2蛋白表达较模型组显著增加（P＜0.05）。

表2　各组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达比较（光密度值，±s）

表2　各组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达比较（光密度值，±s）

组别nBcl-2Bax假手术组100.90±0.07*#1.34±0.09*#模型2 h组100.63±0.05△0.63±0.03△模型4 h组100.75±0.06△0.71±0.04△通心络2 h组100.81±0.07*#1.34±0.10*#通心络4 h组100.73±0.050.81±0.02△益气化瘀方2 h组100.95±0.06*#1.27±0.01*#益气化瘀方4 h组100.89±0.06*#0.87±0.03△

2.3各组心肌细胞Bax表达的比较见表3。假手术组仅见极少数散在的Bax蛋白阳性染色胞质。模型组2 h及4 h的Bax蛋白的表达显著增加（P＜0.05），通心络组和益气化瘀方组2 h及4 h后Bax蛋白表达较模型组减少（P＜0.05）。

表3　各组大鼠心肌细胞Caspase-3、Fas、P53蛋白表达比较（光密度值，±s）

表3　各组大鼠心肌细胞Caspase-3、Fas、P53蛋白表达比较（光密度值，±s）

组别nCaspase-3假手术组100.22±0.01*#模型2 h组100.39±0.01△模型4 h组100.48±0.02△通心络2 h组100.28±0.01*#通心络4 h组100.39±0.02△*益气化瘀方2 h组100.36±0.01△益气化瘀方4 h组100.43±0.02△FasP53 0.28±0.02*#0.32±0.02*#0.65±0.06△0.77±0.03△0.69±0.06△0.83±0.03△0.41±0.02△*#0.51±0.01△*#0.49±0.03△*#0.64±0.03△*#0.45±0.03△*#0.56±0.02△*#0.53±0.04△*#0.54±0.02△*#

2.4各组心肌细胞Caspase-3表达的比较见表3。假手术组仅见极少数散在的Caspase-3蛋白阳性染色胞质。模型组2 h及4 h的Caspase-3蛋白的表达显著增加（P＜0.05），通心络组和益气化瘀方组2 h及4 h后Caspase-3蛋白表达较模型组减少（P＜0.05）。

2.5各组心肌细胞Fas表达的比较见表3。假手术组仅见极少数散在的Fas蛋白阳性染色胞质。模型组2 h及4 h的Fas蛋白的表达显著增加（P＜0.05），通心络组和益气化瘀方组2 h及4 h后Fas蛋白表达较模型组减少（P＜0.05）。

2.6各组心肌细胞P53表达的比较见表3。假手术组仅见极少数散在的P53蛋白阳性染色胞质。模型组2 h及4 h的P53蛋白的表达显著增加（P＜0.05），通心络组和益气化瘀方组2 h及4 h后P53蛋白表达较模型组减少（P＜0.05）。

3　讨论

随着急性心肌梗死再灌注治疗的广泛开展，再灌注损伤的研究也逐渐深入，细胞凋亡是心肌缺血-再灌注损伤的重要机制之一。细胞凋亡是个体发育过程中由一系列基因控制的细胞主动死亡过程。在多数细胞类型中，原癌基因Bcl-2蛋白家族与P53是重要的细胞凋亡调节因子，在细胞凋亡中相互联系，相互作用，从而调控细胞凋亡。研究发现［3］，Bcl-2家族蛋白根据结构功能不同分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。前者主要有Bcl-2，后者主要有Bax，各蛋白之间可形成同源或异源二聚体，构成一个复杂的调控网络，细胞内Bcl-2与Bax的相对比值可能在决定细胞接受凋亡信号刺激后是否发生凋亡过程中起关键作用。比值增加，可抑制细胞凋亡的发生，反之，则促进细胞凋亡。同时细胞凋亡发生是一个复杂的有Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，根据Caspase在凋亡级联反应中的作用位置可分为上游调控其他Caspase活化的始动Caspase如Caspase-1、2、4、5、8等以及下游直接介导细胞凋亡实施的效应Caspase如Caspase-3、6、7等［4-6］。其核心成员为Caspase-3，是细胞凋亡早期阶段激活的关键蛋白酶，在细胞凋亡过程中起中心环节作用，故也被称为死亡蛋白酶，是目前已知的凋亡最后执行因子［7-8］。根据以往的研究，Caspase-3的激活作为判断细胞凋亡严重性的可靠指标之一。若抑制Caspase-3蛋白的激活表达，则可明显减轻凋亡的产生［9-11］。Fas/ Fas-L系统为主的膜受体死亡通路在细胞凋亡发生中起重要作用。Fas-L属于肿瘤坏死因子细胞因子超家族，Fas-L与表达Fas的靶细胞交联后，启动凋亡信号转导途径，导致Fas表达阳性的靶细胞凋亡。

益气化瘀方是本院缪灿铭名中医多年临床经验方，由五指毛桃、三七、丹参、仙鹤草、红景天5味中药制成，具有补益心气、活血化瘀的功效。在本科用于预防冠心病支架内再狭窄［12］。经过多年的临床观察发现，益气化瘀方还能减轻急性心肌梗死急诊PCI后的再灌注损伤。本次动物实验证实，该方可以减少大鼠急性心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡，且能减少促进心肌细胞凋亡的相关调节蛋白Bax、Caspase-3、Fas及P53的表达，增加抑制心肌细胞凋亡的相关调节蛋白Bcl-2表达，且与通心络胶囊在抑制缺血再灌注后心肌细胞凋亡方面有相似功效。现代药理研究证实，益气化瘀方中五指毛桃所含补骨脂素具有抗凝、免疫调节、激素样作用［8］。三七有效成分三七总皂苷对心肌缺血再灌注损伤有很强的保护作用，对AngⅡ诱导的细胞凋亡具有明显抑制作用，主要抑制心肌细胞内钙超载，从而保护心肌细胞［9］。丹参中丹参酮Ⅱ具有抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量、缩小心肌梗死面积等多种心血管药理活性作用［10］；红景天能使机体整体的耗氧速度速度降低、提高对缺氧的耐力，同时增加血液的载氧能力，增加机体抗病能力。全方合用，可达抗凝、减轻钙超载、抑制心肌细胞凋亡、缩小心肌梗死面积、改善心肌耗氧等作用，从而减轻缺血再灌注损伤。

因该实验方法是持续给药7 d后进行，与临床上急性心肌梗死介入治疗术前紧急给药有一定差异，故而有一定局限性，具体结果还需要临床进一步验证。

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Effect of Yiqi Huayu Decoction on the Expression of Apoptosis Related Proteins in Myocardial Cells of Rats with Ischemia Reperfusion Injury

LIN Kaixuan，AN Hui，Miao Canming，et al.Zhongshan Affiliated Hospital of Guangzhou TCM University，Guangdong，Zhongshan 528400，China

Objective：To investigate the Yiqi Huayu Decoction on myocardial cell apoptosis and Bcl-2，Bax，Caspase-3，fas and P53 protein expression in experimental rats with myocardial ischemia and reperfusion（ischemia/reperfusion，I/R）and to analyze the pathological damage in myocardial tissue.Methods：The myocardialischemia-reperfusion injury model was established by occluding the left anterior descending branch of coronary artery for 30 minutes and removing the ligation later to reperfusion for 2 hours，4 hours.Forty-two rats were randomly divided into seven groups：the normal（Normal）group，the sham operation（Sham）group，the saline ischemia-reperfusion 2 hours（NS-2 h）group，the saline ischemia-reperfusion 4 hours（NS-4 h）group，Tongxinluo control 2 hours group（TXL-2 h），Tongxinluo control 4 hours group（TXL-4 h），Yiqi Huayu Decoction treatment 2 hours group（YQ-2 h），and Yiqi Huayu Decoction treatment 4 hours group（YQ-4 h）.Bcl-2，Bax Caspase-3，Fas and P53 protein expression were tested by immunohistochemical staining method.Results：Yiqi Huayu Decoction increased the Bcl-2 protein expression（P＜0.05）and reduced the Bax，Caspase-3，Fas and P53 protein expression（P＜0.05）in rats with myocardial ischemia.Conclusion：The mechanism of Yiqi Huayu Decoction against myocardial apoptosis may be related to the increase of Bcl-2 protein expression and decrease of Bax，Caspase-3，Fas and P53 protein expression.

Myocardialischemia-reperfusion injury；Myocardial apoptosis；Yiqi Huayu Decoction；Bcl-2 protein；Bax protein；Caspase-3 protein；Fas protein；P53 protein

R285.5

A

1004-745X（2015）11-1936-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.017

2015-07-05）

·综述·

广东省中山市科技局科技计划立项重大项目（20113A003）