健脾补肾方对BALBc鼠大肠癌肝转移VEGF表达影响的实验研究*

金妙妙　傅健飞

（浙江省金华市中心医院，浙江金华321000）

·研究报告·

健脾补肾方对BALBc鼠大肠癌肝转移VEGF表达影响的实验研究*

金妙妙傅健飞

（浙江省金华市中心医院，浙江金华321000）

目的探讨健脾补肾方对BALBc鼠大肠癌肝转移血管内皮生长因子（VEGF）表达影响性。方法先对BALBc鼠大肠癌肝转移进行模型，随机分成环磷酰胺组、生理盐水组和健脾补肾方组，各组均进行各自药物灌胃处理，每日1次，共2周，检测每组VEGF表达情况。结果抑瘤率上，生理盐水组为0，环磷酰胺组为35.40%，健脾补肾方组为29.90%，3组两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）；脾脏指数上，生理盐水组为（8.97±0.31）mg/g，环磷酰胺组为（8.22±0.14）mg/g，健脾补肾方组为（9.11±0.13）mg/g，生理盐水组和环磷酰胺组、环磷酰胺组和健脾补肾方组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；VEGF表达率上，生理盐水组“-”“+”“++”分别占8.33%、8.33%、83.33%，环磷酰胺组分别占41.67%、25.00%、33.33%，健脾补肾方组分别占33.33%、25.00%、41.67%，环磷酰胺组和健脾补肾方组VEGF表达比较差异无统计学意义（P＞0.05），而生理盐水组和环磷酰胺组、生理盐水组和健脾补肾组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论健脾补肾方能通过降低BALBc鼠大肠癌肝转移VEGF表达提高临床效果。

健脾补肾方BALBc鼠大肠癌肝转移血管内皮生长因子

结直肠癌是临床上常见恶性肿瘤，其中肝转移是造成死亡的最常见原因。研究［1］称，血管内皮生长因子（VEGF）是结直肠癌肝转移特异性指标。中医学认为，大肠癌肝转移是本虚标实证，素体正气不足，加上饮食不洁、脾肾亏虚、内生痰湿，滞留肠道气机受阻，运行不畅阻于脉络后形成大肠癌，随着病情日渐恶化，湿毒瘀滞造成正气日渐亏虚，在临床上常见是脾肾两虚证，其中正虚表现为脾虚和肾虚，邪实是热毒、瘀血和湿热等外在原因造成，故其主要原因是脾肾亏虚。本次研究就观察健脾补肾方对BALBc鼠大肠癌肝转移VEGF表达影响性，以期寻找其中相关性，提高临床诊治水平。现报告如下。

1　资料与方法

1.1动物与细胞随机选取36只BALBc小鼠为研究对象，分成3组，每组12只，均为雄性，平均体质量（50.00±10.00）g，均购自中山大学实验动物中心提供，合格证编号为20130112C。选用细胞为结肠癌细胞株CT26细胞，保证选用细胞为50代以内对数生长期CT26细胞。

1.2试剂与仪器健脾补肾方，药物组成为黄芪30 g，白术15 g，熟地黄15 g，补骨脂10 g，蛇六谷15 g，神曲20 g，甘草6 g等，均由上海中医药大学附属医院提供，双蒸水震荡混匀，使用超声促使药物混合均匀，每毫升药液含0.2185 g生药，-20℃冰箱内保存。环磷酰胺（国药准字H22022988，通化茂祥制药有限公司）200 mg混合0.9%氯化钠注射液20 mL备用。VEGF抗体购自美国西门子公司，凝胶制备试剂盒、蛋白抽取试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒等均购自天云生物技术有限公司。高精确电子天平、台式高速冷冻离心机、电热恒温水浴锅等均购自南京天科生物科技有限公司提供。

1.3分组与造模随机将小鼠分成环磷酰胺组、生理盐水组和健脾补肾方组，每组12只。取已禁食12 h的小鼠麻醉后在背侧中部、左侧腋中线和腋后线间，取1.5 cm切口进入腹腔内，暴露脾脏，按0.2 mL/只注入对数生长期大肠癌CT26细胞悬液，按压无出血后将脾脏置于原位，缝合腹壁，直至出现肝转移。

1.4给药方法造模后对每组予相应药物治疗，生理盐水组予0.9%氯化钠注射液0.4 mL；环磷酰胺组予环磷酰胺20 mg/kg；健脾补肾方组予健脾补肾方0.2 mL。各组均每日灌胃治疗1次，持续两周。

1.5标本采集及检测1）给药2周后停药1 d，处死小鼠，剥离瘤块标本，用0.9%氯化钠注射液冲洗2次，用滤纸吸干表面水分，称瘤质量，计算抑瘤率，抑瘤率=1-（试验组平均瘤质量/生理盐水组瘤质量）。2）分离脾脏后用电子天平秤质量，计算脾脏指数，指数=脾脏质量/小鼠体质量。用免疫组化法检测肿瘤细胞VEGF表达情况。3）分离肿瘤组织，用甲醛固定1 d，取肿瘤组织切成小块流水冲洗30 min，经脱水-透明-浸蜡-包埋制成肿瘤组织石蜡标本。将石蜡用且片机切片，厚度为4 μm，切片经3次PBS清洗后滴加三抗，DAB显色，复染、透明后封片。VEGF阳性表达采用SP免疫组化染色进行检测，以出现棕黄色颗粒为阳性，阳性表达结合相关文献［2］进行计分。计分由两部分组成，一部分为细胞染色强度计分，不显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按显色细胞比例计分，1/3以下为1分，1/3～2/3为2分，2/3以上为3分。积分数为以上两部分乘积，阴性为乘积0分（“-”表示），弱阳性为乘积1～4分、低表达（“+”表示），两者乘积在4分以上为强阳性，高表达（“++”表示）。

1.6统计学处理采用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，并对数据采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组抑瘤率指标比较见表1。各组抑瘤率比较，生理盐水组和环磷酰胺组、生理盐水组和健脾补肾方组、环磷酰胺组和健脾补肾方组在抑瘤率上比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1　各组瘤质量、抑瘤率、脾脏指数比较

2.2各组脾脏指数比较各组比较，生理盐水组和环磷酰胺组、环磷酰胺组和健脾补肾方组在脾脏指数上比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），而生理盐水组和健脾补肾方组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3各组VEGF表达比较见表2。结果为生理盐水组和环磷酰胺组、生理盐水组和健脾补肾方组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而环磷酰胺组和健脾补肾方组VEGF表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2　各组VEGF表达比较n（%）

3　讨论

虽然中医学无大肠癌肝转移确切病名，但古籍有记载“脏毒者，蕴毒流注肛门结成肿块，有虚劳久嗽，痰火结肿，肛门如栗者，破必成漏，沥尽气血必亡”。中医学认为瘀毒内结、脾气亏虚、气滞血瘀是肿瘤转移的基本病机。研究［3］称，健脾补肾能提高机体免疫力，能抑制肿瘤生长和复发转移，对肿瘤血管生成有明显抑制作用。

在本次研究中，以黄芪和补骨脂为君药，黄芪有行气健脾功效，补骨脂有温补脾肾效果，两者共用能达到VEGF是目前为止发现的可溶性最强，特异性最高的微血管生长正向调节因子，其能改善细胞外基质，增加微血管通透性，降解并转化胶原结缔组织，为肿瘤生成、侵袭和转移提供适合基础［6-7］。本次结果显示，健脾补肾方组在VEGF表达上明显低于生理盐水组，这说明健脾补肾方能降低VEGF表达从而降低大肠癌浸润和转移。研究［8］称，VEGF和肠癌分化程度、浸润程度、转移情况等均有相关性，分化程度越低、浸润转移越远，其表达也相对越高。有研究［9］指出，黄芪皂苷能下调VEGF水平从而达到和环磷酰胺同样的抗肿瘤效果，这在本次研究中有所体现，这说明了健脾补肾方能通过下调大肠癌肝转移的VEGF因子表达从而达到抑制肿瘤生长、浸润作用。

健脾补肾之能；白术是益气健脾常用药物，熟地黄可滋补肾阴，填精益髓；蛇六谷能散结消肿、燥湿化痰，神曲则消食，配合甘草调和诸药，共达到补脾气、填肾精、消结节等功效，能提高患者生存质量，减少复发和转移［4］。现代药理学认为，补骨脂能抑制癌细胞糖代谢，核酸代谢和能量代谢等，从而达到抗肿瘤效果；白术能促使淋巴细胞寿命延长，起到免疫调节作用，白术多糖能调节淋巴细胞功能和抗肿瘤作用；熟地黄能降低膜磷脂代谢并改善脂肪酸组成，影响细胞表面特性并转运膜代谢，从而抑制肿瘤细胞增殖产生抗肿瘤作用［5］；黄芪对人体有双向调节作用，蛇六谷能通过影响癌细胞能量代谢从而抑制肿瘤生长。结果看出，应用健脾补肾方治疗后，患者在脾脏指数和抑瘤率上明显得到改善，这说明了中医药对大肠癌肝转移有很好疗效。

伴随着恶性肿瘤在临床上发病率越来越高，中医药治疗已经成为综合治疗很大一部分，中医药能提高患者对化疗等耐药性，改善生活质量，缓解不良反应，能减少手术后的肿瘤复发和转移［10］，在一定程度上能延长患者生存时间，故有很大的实际临床意义。

［1］周丽萍，马科，马治国，等.健脾补肾方对小鼠Lewis肺癌抑制作用及对VEGF、CD44V6表达的影响［J］.宁夏医科大学学报，2012，34（4）：319-322.

［2］王希胜，肖红艮.健脾补肾方对Lewis肺癌移植瘤小鼠EGFR和VEGF表达的实验研究［C］.2013年全国中医肿瘤学术年会论文集，2013：395-398.

［3］周丽萍.健脾补肾方对小鼠Lewis肺癌生长抑制作用及其机制的实验研究［D］.银川：宁夏医科大学，2012.

［4］肖红根.健脾补肾方对Lewis肺癌移植瘤小鼠EGFR和VEGF表达的实验研究［D］.咸阳：陕西中医学院，2013.

［5］高军，高国兰，余筱琳，等.P53和VEGF在SKOV3荷瘤裸鼠不良心理应激模型血清及移植瘤中的表达及意义［J］.天津医药，2012，38（12）：1072-1075.

［6］秦跃红，王功朝，刘滨，等.星形细胞肿瘤组织中VEGF-A、VEGF-C的表达变化及其与肿瘤血管生成的关系［J］.山东医药，2014，2（15）：1-3.

［7］宋冀东，闫继东.Smad4和VEGF在人非小细胞肺癌组织中的表达及其相关性分析［J］.中国实验诊断学，2014，5（11）：1781-1784.

［8］马科，吴学勤，周丽萍，等.健脾补肾方对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞抑制作用及对Ki-67表达影响的研究［J］.时珍国医国药，2012，23（9）：2176-2177.

［9］董妙.健脾补肾方对Lewis肺癌移植瘤小鼠COX-2和PTTG表达的影响［D］.咸阳：陕西中医学院，2014.

［10］张正，严灿，李艳，等.反复心理应激大鼠下丘脑及脑海马氨基酸含量变化及调肝方、健脾方、补肾方、人参总皂苷作用的比较［J］.中国临床康复，2012，9（48）：179-181.

Experimental Study of Jianpi Bushen Decoction on the Expression of VEGF in BALBc Rat with Liver Metastasis of Colorectal Cancer

Metastasis of Colorectal Cancer
JIN Miaomiao，FU Jianfei.Central Hospital of Jinhua City，Zhejiang Province，Zhejiang，Jinhua 321000，China

Objective：To investigate the effects of Jianpi Bushen Decoction on the expression of VEGF in BALBc rat with liver metastasis of colorectal cancer.Methods：At first，BALBc mouse model was made with liver metastasis of colorectal cancer，and randomly divided into the cyclophosphamide group，the saline group and Jianpi Bushen Decoction groups.Each group was treated with drug perfusion once per day，lasting for 2 weeks，and the expression of VEGF was detected.Results：As for the inhibition rate，the saline group was 0，the cyclophosphamide group 35.4%，Jianpi Bushen Decoction group 29.9%，with statistical significance（P＜0.05）；as for the spleen index，the saline group was（8.97±0.31）mg/g，the cyclophosphamide group（8.22±0.14）mg/g，Jianpi Bushen Decoction group（9.11±0.13）mg/g；there was statistical significance between the saline group and the cyclophosphamide group，and between the cyclophosphamide group and Jianpi Bushen Decoction group（P＜0.05）. As for the expression of VEGF，-，+，+of the saline group was respectively 8.33%，8.33%and 83.33%，the cyclophosphamide group 41.67%%，25.00%and 33.33%，Jianpi Bushen Decoction group 33.33%，25%，41.67%. The difference in the cyclophosphamide group and Jianpi Bushen Decoction group in VEGF expression was not statistically significant（P＞0.05），while the difference between the two groups was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：spleen and kidney in order by reducing BALBc mouse VEGF expression in colorectal liver metastases improve clinical results.

Jianpi Bushen Decoction；BALBc mouse；Liver metastasis of colorectal cancer；Vascular endothelial growth factor

R285.5

A

1004-745X（2015）11-1906-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.008

2015-05-01）

·急症建设管理·

浙江省自然科学基金项目（LY13H190006）