长角血蜱雌蜱不同发育时期唾液腺蛋白的组成分析

王 多，李海龙，刘敬泽

（河北师范大学生命科学学院，石家庄 050024）

长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）隶属硬蜱科（Ixodidae）血蜱属（Haemaphysalis），在我国分布广泛[1]，能够传播伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）、贝氏考克次体（Coxiella burnetti）、埃里克体（Ehrlichia）、巴贝斯虫（Babesia spp.）、泰勒虫（Theileria spp.）等多种病原体[2-3]，对人类健康和畜牧业发展有极大危害[4].最新报道的新布尼亚病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）对长角血蜱的感染率为18.75%，且与病人的SFTSV聚在一支，表明SFTSV、病人和长角血蜱存在一定的关联，长角血蜱极可能是SFTSV传染的传播媒介[5].

长角血蜱唾液腺（salivary gland，SG）位于体腔腹侧面，由一对葡萄状的腺泡组成.蜱唾液腺功能强大，在蜱类自由生活阶段和吸血寄生过程中均发挥重要作用[6].蜱唾液腺还可储存莱姆病、Q热等多种疾病的病原体，并通过唾液将病原体传递至宿主[7-8].目前已从蜱唾液腺中发现许多抑制免疫反应和具有抗菌功能的蛋白，包括组胺结合蛋白、IgG结合蛋白、IL-2结合蛋白、p29蛋白和HL34等[9-11].因此，蜱唾液腺蛋白已成为生物学、免疫学和生物药学研究的热点领域之一[12].刘光远等[13]和谢俊仁等[14]构建、筛选了长角血蜱唾液腺的cDNA文库；Lee等[15]对唾液腺病原体进行了检测；Shelby等[16]研究了激素对美洲花蜱（Ambylomma americanum）唾液腺发育的影响.唾液腺蛋白的含量和成分在蜱不同发育期的变化尚未报道.本研究以长角血蜱雌蜱为对象，分析其不同发育期唾液腺蛋白含量和成分的动态变化，以期为后续深入研究唾液腺蛋白及其功能奠定基础.

1 材料与方法

1.1 长角血蜱的采集与饲养

长角血蜱采自河北省小五台山国家级自然保护区的羊体，在实验室条件下饲养繁殖.在家兔耳部进行寄生吸血，非寄生期在实验室光照培养箱中培养，培养温度为（27±1）℃，相对湿度75%，光照时间与黑暗时间的比例为6∶18.

1.2 长角血蜱雌蜱不同发育期唾液腺蛋白含量的测定

选取处于饥饿期（U）、吸血后 2 d（F2）、交配期（M）、饱血当天（E0）、饱血后 2 d（E2）和饱血后 4 d（E4）的雌蜱各50头，冰浴条件下，在缓冲液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.2）中解剖出唾液腺，超声破碎.4℃离心20 min（12 000 r/min），取上清液，－80℃保存备用，Bradford法进行蛋白质含量定量.

1.3 不同发育期雌蜱唾液腺蛋白成分的测定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定雌蜱唾液腺蛋白的成分[17].将提取的雌蜱唾液腺总蛋白溶液按照体积比为1∶0.2的比例加入质量分数为10%的SDS和微量溴酚兰，混匀后在沸水中热处理3 min，之后上样.电泳条件为：质量分数为5%的浓缩胶，电压设置为75 V，质量分数为12%的分离胶，电压设置为120 V.电泳结束后取下凝胶，考马斯亮兰R250染色，酸甲醇脱色液脱色.Omega 12ic凝胶成像系统拍照，Gel-Pro Analyzer 4.0软件进行分析.

2 结果

2.1 不同发育期雌蜱唾液腺总蛋白的含量

雌蜱唾液腺总蛋白含量随发育期的不同而变化，且各期的蛋白含量差异显著，具有统计学意义（p＜0.05），如图1所示.

图1 长角血蜱雌蜱不同发育期唾液腺总蛋白的含量Fig.1 Total protein content of salivary gland in femaleh.longicornis at different developmental stages

由图1可以看出，饥饿期雌蜱的唾液腺蛋白含量最低（9.51μg/头）.随着吸血时间的延长，蛋白含量逐渐升高，至交配期唾液腺蛋白含量出现峰值（84.40μg/头）.随后，唾液腺蛋白的含量逐渐下降，饱血后4 d时蛋白含量仅为峰值的1/4.

2.2 不同发育期雌蜱唾液腺蛋白成分的变化

长角血蜱雌蜱的唾液腺蛋白经PBS提取后，利用SDS-PAGE进行分析，结果如图2所示.

图2 不同发育期长角血蜱雌蜱唾液腺蛋白成分Fig.2 Protein profile of salivary gland in femaleh.longicornis at different developmental stages

由图2可以看出，随着吸血时间的延长，雌蜱唾液腺蛋白的条带变化明显.饥饿期雌蜱唾液腺蛋白带出现17条，吸血后2 d（F2）蛋白条带增加至23条.交配时雌蜱唾液腺蛋白的条带数最多，达到26条，交配后至饱血后4 d，蛋白条带无明显变化，保持在26条.从饥饿期至饱血后4 d，各发育期均有5条明显主带，其蛋白相对分子质量由大到小为97、84、74、45和32 kDa.

3 讨论与结论

蜱类在叮咬吸血过程中，唾液腺质量增加，结构重组明显，分泌多种功能物质抑制宿主免疫反应，进而使其成功获得宿主血液，并有助于传递病原体至宿主，如蜱类分泌的唾液能够刺激宿主IL-10和IL-4等细胞因子的合成，进而可以选择性地减少巨噬细胞或淋巴细胞的产生，降低宿主对蜱类或病原体的免疫反应[18].长角血蜱唾液腺鉴定出的黏合剂成分则有助于吸血过程中口器固定[19].此外，不断有抗凝血酶、抗菌肽等蛋白类功能物质在蜱类唾液腺中被鉴定出，由此可见蜱类唾液腺蛋白在蜱类生命活动过程中发挥着重要作用.本研究对长角血蜱不同发育期的唾液腺蛋白含量及成分进行分析，结果表明，饥饿期长角血蜱雌蜱的唾液腺蛋白含量最低，交配期蛋白含量最高，饱血后蛋白含量开始下降.该过程可能与蜱类的饱血过程密切相关，吸血初期蜱类的吸血缓慢，唾液腺逐渐发育，体积变大，蛋白含量上升.交配可以使长角血蜱进入快速吸血期，此时蜱类唾液腺功能最为强大，蛋白含量达到峰值.饱血后，蜱类唾液腺逐渐退化，体积变小，蛋白含量逐渐降低.

SDS-PAGE分析表明，随着吸血的进行，长角血蜱雌蜱的唾液腺蛋白成分不断增加，饥饿期唾液腺蛋白为17条，吸血初期增加至23条，交配期达到峰值，交配期至饱血后蛋白条带无明显变化.这表明吸血的起始能够促进唾液腺发育，触发唾液腺分泌功能蛋白，如黏合剂蛋白、抗凝血酶蛋白等，这些蛋白有助于蜱类叮咬吸血的持续进行.交配后长角血蜱进入快速吸血期，多种唾液腺蛋白共同作用促进长角血蜱大量吸血.交配期至饱血后蛋白条带虽无明显变化，但蛋白含量明显降低，表明蜱类唾液腺在饱血后发育过程中的功能逐渐下降，唾液腺逐步退化.在整个吸血至饱血过程中，5条蛋白主带有明显变化.97 kDa蛋白主带饥饿期存在，吸血2 d后含量增多，交配期和饱血当天含量最为丰富，饱血后含量逐渐降低，该蛋白与唾液腺蛋白含量变化趋势一致.45 kDa蛋白不仅在长角血蜱雌蜱的唾液腺中可检测到，在美洲花蜱（Amblyomma americanum）、变异革蜱（Dermacentor variabilis）和达明硬蜱（Ixodesdammini）中都有存在[20]，这表明唾液和唾液腺中的一些蛋白成分在硬蜱中具有一定的保守性.

目前蜱类唾液腺的研究多集中于病原体及生理功能方面，而唾液腺发育调控因子及作用机理、功能蛋白的分离、纯化和结构鉴定以及蛋白质组学等方面的研究亟待开展.此类研究对于蜱类防治、人类健康及农牧业的发展将具有重要意义.

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