白僵菌不同菌株对美国白蛾幼虫的致病力及田间应用研究

白鹏华，白义川，冯友仁，刘宝生

（天津市植物保护研究所，天津300381）

重大植物检疫害虫—美国白蛾（Hyphantria curea Drury）属鳞翅目（Lepidoptera）灯蛾科（Arctiidae），是一种多食性的检验检疫害虫，可危害636种植物，在中国的寄主植物有300多种[1-2].美国白蛾于1979年入侵中国，目前在辽宁、天津、山东、河北、北京、陕西等省市均有发生，并有进一步扩散传播的趋势，严重威胁林业生产和园林绿化.有报道表明[3]：2004年美国白蛾的发生面积为11.7万hm2，在全国所造成的非经济损失合计为140.35亿元，平均为11.99万元/hm2.目前，对美国白蛾主要是靠投入大量财力、物力进行化学防治，虽然可以在局部地区取得一定的控制效果，但容易引起美国白蛾产生抗药性，对环境污染严重，也大量杀伤了天敌，造成了年年防虫、年年有灾的局面，不符合生态和可持续控制的有害生物综合防治措施[4].因此，无公害防治美国白蛾已成为当今研究热点之一，其中以菌治虫生防措施引起广泛关注.

白僵菌（Beauveria bassiana）是目前世界上防治害虫应用较广、被公认为最有前途的一种虫生真菌[5].白僵菌具有生产方便、成本低廉、致病力强、不伤害天敌、对人畜无毒害、不污染环境、可扩散流行等优点，具有非常高的生物防治价值[6].国外研究表明，白僵菌与青蒿和薰衣草提取物联合防治不同寄主的美国白蛾效果显著[7]；刘宝生等[8]研究发现球孢白僵菌对美国白蛾1龄幼虫具有较强的致病力；刘永清等[9]研究表明白僵菌菌株对美国白蛾5龄幼虫有较高的侵染效果；李龙等[10]采用饲喂、口服、表皮接触和血腔注射4种生测方法测定白僵菌代谢提取物对美国白蛾幼虫的毒性，结果表明血腔注射所表现出的毒性最高.本研究选用不同来源的11株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株，以室内生测法研究其对美国白蛾幼虫的毒力，为美国白蛾的生物防治提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 供试虫源与白僵菌分生孢子粉

供试各白僵菌菌株经预先活化后接种于沙氏平板培养基上，恒温25℃下培养14 d.

1.2 供试菌种

对获得的11个白僵菌菌种进行分离、培养，具体菌株代号与来源如表1所示.

表1 11株白僵菌菌种来源Tab.1 Origin of 11 strains of B.bassiana studied

通过形态学和分子生物学方法鉴定11个菌种均为球孢白僵菌[11]，保存于天津市植物保护研究所林业病虫害研究室.

1.3 白僵菌菌株对美国白蛾幼虫致病力和毒力测定方法

1.3.1 致病力测定

本研究采用定量涂抹法制成含白僵菌的法桐叶片，饲喂美国白蛾幼虫.首先配制11个白僵菌菌株的孢子悬浮液母液，测量孢子含量后，再稀释成1×108mL-1溶液.将法桐叶片洗净，置室内晾晒，待表面水分晾干后，剪成直径90 mm的圆形.每张叶片涂抹350μL的孢子悬浮液，以涂抹质量分数为0.05%的吐温80灭菌水为空白对照处理.含菌叶片经室内晾晒，表面水分晾干后备用.

各处理培养皿内垫4层面巾纸，加足无菌水并控出多余水分.将含菌叶片移入培养皿，每皿1张，每处理重复3次（即3个培养皿）.每个培养皿接虫20头.培养皿接虫后，皿盖与皿底间用面巾纸密封，防止幼虫逃逸.将所有处理培养皿置于25℃恒温培养箱内，在湿度80%～90%下饲养，适时更换带毒叶片.

观测96、120和144h时各处理的活虫和死虫数量，计算各处理下的校正死亡率.

校正死亡率（%）=[（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照死亡率）]×100[6]

4.1.3 单位面积收益变化。分析图5-3数据可以看出，品牌胶州大白菜的经济效益也大幅提高——每亩大白菜收入从品牌发展阶段初期2009年的9620.80元增至2016年的12500.93元。品牌胶州大白菜的收益远高于全国平均水平，且差距不断拉大，由2009年高于全国9469.33元拉大到11545.08元，胶州大白菜种植户生活水平得到提高。

1.3.2 高致病菌株的毒力测定

经过室内致病性的测定后，筛选出4株高致病白僵菌.预先配制这些菌株的孢子悬浮液母液，测量孢子含量后，稀释成 1×108、1×107、1×106、1×105和 1×104mL-15个处理剂量，以质量分数为0.05%的吐温80灭菌水为空白对照组，计算4株高致病白僵菌的毒力回归方程.含菌叶片的制备方法和饲喂美国白蛾幼虫的方法同1.3.1.毒力测定中所有处理的幼虫基数均为60头，观测 24、48、72、96、120 和 144h 时各处理下的活虫、死虫和白僵虫的数量，计算各处理组的校正死亡率.

以美国白蛾幼虫第5天的校正死亡率为50%的白僵菌浓度来计算4株白僵菌对美国白蛾幼虫的半致死浓度（LC50）.以菌株孢子悬浮液浓度1×108mL-1使校正死亡率为50%的时间来计算半致死时间（LT50）.

1.4 田间防治实验

分别将球孢白僵菌菌株 Bb10331、Bb7725、Bb7716和Bb87303的孢子粉配制成浓度为1×108mL-1的悬浮液.实验地点位于天津市西青区（117.00°E，39.13°N），实验树木为2年生的欧美速生杨108，树高2.5～3.0 m，株行距为2 m×2 m.2011年8月2日，选择4个区进行喷施，每小区3株树，小区间设保护行，以清水为对照组.将幼虫接到杨树林地套好尼龙网袋的枝条叶片上，喷药前调查每个尼龙网袋内的活虫数量，以此为基数，待稳定取食24h后喷药，在喷药后的第2、7和10天调查虫口数量.

防除效果（%）=[1-空白对照区的药前虫数×药剂处理区药后虫数/（空白对照区药后虫数×药剂处理区药前虫数）]×100[12]

1.5 数据分析

利用Excel计算校正死亡率，DPS软件计算毒力回归方程的a和b值、LC50和LT50、相关系数r和95%置信区间值.

2 结果与分析

2.1 11株白僵菌对美国白蛾幼虫的致病力

本研究用11个菌株作用于美国白蛾幼虫，室内致病力结果如表2所示.

表2 不同白僵菌菌株作用下美国白蛾幼虫的校正死亡率Tab.2 Corrected mortality of larvae ofh.curea treated with different strains of B.bassiana %

由表2可以看出，随着白僵菌作用时间的延长，美国白蛾幼虫的校正死亡率增大.11个菌株中，Bb7725作用下的校正死亡率最大，除了96h时与Bb10331差异不具有统计学意义外（p＞0.05），其他时间均显著高于另外的10个菌株，差异具有统计学意义（p＜0.05）.致病力较强的菌株还有 Bb0331、Bb87303和Bb7716，3个菌株之间的差异不具有统计学意义（p＞0.05），致病力略低于Bb7725，但显著高于其他的7个菌株.

2.2 4株高致病性球孢白僵菌的毒力测定

从11个球孢白僵菌菌株中筛选出4个高致病性菌株，毒力测定结果如表3和表4所示.

表3 4株高致病性球孢白僵菌对美国白蛾幼虫的LC50Tab.3 LC50 of four strainsof B.bassiana againsth.curea

表4 4株高致病性球孢白僵菌对美国白蛾幼虫的LT50Tab.4 LT50 of four strains of B.bassiana againsth.curea

毒力测定结果中，LC50值和LT50值越小，表明球孢白僵菌菌株对美国白蛾幼虫的毒力越强.由表3和表4可以看出，菌株Bb7725的LC50值和LT50值最小，即毒力最强；其次是菌株Bb10331；4个菌株中，Bb7716的毒力最低.

2.3 4株白僵菌对美国白蛾幼虫的田间控害效能

4株高致病性球孢白僵菌菌株在孢子悬浮液浓度为1×108mL-1时，对美国白蛾幼虫的田间防治效果如表5所示.

表5 高致病性球孢白僵菌菌株对美国白蛾田间的防除效果Tab.5 Controlling effect of highly infecting B.bassiana againsth.curea in field %

由表5可以看出，田间实验条件下，4株高致病性球孢白僵菌作用于美国白蛾幼虫后，第2天的防除效果较低，说明白僵菌对美国白蛾幼虫防治的速效性差.随着作用时间的延长，到了第7天，防除效果增加了近10倍，时间继续延长，美国白蛾幼虫的死虫数量略有增加，但与第7天的防除效果之间的差异较小.比较4个菌株，依然是Bb7725的防除效果显著高于其他3个菌株，差异具有统计学意义（p＜0.05）；其次是菌株Bb10331；Bb87303的防除效果最差.

3 讨论与结论

本研究以不同来源的11株球孢白僵菌饲毒培养美国白蛾低龄幼虫，筛选出4株高致病性的菌株，分别为 Bb7725、Bb10331、Bb87303 和 Bb7716，美国白蛾幼虫在144h后的累计校正死亡率均超过90%.对4个菌株进行毒力测定，从致死剂量效应来看，4个菌株孢子的 LC50值为 3.28×106～6.42×106mL-1，这与王西南等[13]的研究结果相似，高于刘永清等[9]的研究结果.从致死时间效应来看，在孢子悬浮液浓度为1×108mL-1时，4个菌株孢子的LT50为71.13～94.36h，与白僵菌对西花蓟马的LT50值相近[14-15].从4个菌株田间防控实验的效能来看，在药后7～10 d，4个菌株均表现出较强的侵染致病力（74.40%～87.29%），且Bb7725和Bb10331菌株的防除效果在药后10 d均超过85%.田间控害效能综合反映了菌株的毒力、菌株对环境条件的适应性以及寄主抵御菌株的抗性能力.Bb7725、Bb10331、Bb87303和Bb7716等4个菌株对美国白蛾幼虫的防治效果显著，尤其是Bb7725，具有开发生防菌的潜力.

研究发现白僵菌不同的寄主来源及不同的温、湿度环境均能够影响其致病性[16-19].因此，针对不同白僵菌菌株对美国白蛾致病力的差异仍需继续探讨，以期通过环境改善及基因改造技术获得毒力强、高稳定性的白僵菌菌株.

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