巨刺对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织VEGF和Ang-1蛋白表达的影响*

石学慧　张素兰　曹夏　王凌燕　段霞　刘未艾　张志萍△

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南长沙410005；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208）

·研究报告·

巨刺对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织VEGF和Ang-1蛋白表达的影响*

石学慧1张素兰2曹夏2王凌燕2段霞2刘未艾1张志萍1△

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南长沙410005；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208）

目的观察巨刺对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织VEGF和Ang-1蛋白表达的影响，探讨巨刺治疗脑缺血再灌注损伤可能的作用机制。方法雄性SD大鼠按随机数字表法随机分为空白组、假手术组、模型组、健侧针刺（即巨刺法）组、患侧针刺组。各组再分为3 d和14 d两个亚组。采用改良线栓法制备脑缺血再灌注损伤大鼠模型。于再灌注24 h后，健侧针刺组针刺人中、百会及电针健侧穴位；患侧针刺组针刺人中、百会及电针患侧穴位。电针选用疏密波，每次持续刺激30 min，每日1次。分别于3 d和14 d光镜下观察大鼠缺血脑组织结构；采用免疫组化法（S-ABC法）测定大脑皮质血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素-1（Ang-1）蛋白表达的变化。结果针刺治疗后大鼠缺血区脑组织损伤程度明显改善，其中健侧针刺组较患侧针刺组改善明显；健侧针刺组、患侧针刺组VEGF及Ang-1的表达均较模型组增多（P＜0.05）；而健侧针刺组的表达较患侧针刺组显著增多（P＜0.05）。结论巨刺能够明显改善再灌注损伤大鼠缺血区脑组织损伤程度，其机制可能与上调脑组织VEGF和Ang-1表达有关。

巨刺脑缺血再灌注损伤血管内皮生长因子血管生成素-1脑组织

近年来我国缺血性脑血管病发病呈现年轻化的趋势，且致残率居高不下。研究表明，缺血缺氧刺激和临床溶栓药物的使用在血管再通、血流供应恢复的同时往往带来再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤是指缺血脑组织恢复血供后，脑组织损伤反而进一步加重。针灸不仅能治疗缺血性脑病，而且对防治脑缺血再灌注损伤方面也取得了一定成效［1］。巨刺治疗中风偏瘫古已有之，现代报道亦疗效满意，并且具有普通针刺所不具备的可配合运动疗法、不加重患侧痉挛程度等优点。然而相关实验研究较少，缺乏客观的指标说明其治疗机制。研究发现，脑缺血后微血管新生促进血流恢复和氧供的同时为神经再生和突触发生创造了条件，影响神经功能恢复，也决定着预后。而血管生成与血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素（Ang）这两种主要的促血管生成因子密切相关。VEGF作用于血管形成早期，促进原始血管网形成；Ang则作用于随后的血管改建，促进形成成熟的血管网。因此本实验观察巨刺对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织VEGF和血管生成素-1（Ang-1）蛋白表达的影响，探讨巨刺治疗脑缺血再灌注损伤可能的作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物清洁级健康SD雄性大鼠140只，体质量（260±20）g，湖南中医药大学动物实验中心提供，在实验前与实验中分批购入，动物合格证号：SCXK（湘）2013-0004，饲养温度20～25℃，相对湿度50%～70%。

1.2实验材料电针仪，M6805-Ⅰ型；华佗牌31号0.5寸无菌针灸针；VEGF、Ang-1免疫组化（S-ABC法）试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3模型制备造模方法参照Zea Longa线栓法制备模型［2］，栓塞2 h后拔出鱼线再灌注。假手术组不阻塞大脑中动脉，插线深度5 mm左右，其余手术步骤同模型组。造模动物在自然苏醒后，按照Zea-Longa神经缺损体征评分标准评分［2］。造模后即刻评分，为1～3分者纳入实验，未达标准者剔除。

1.4分组与干预采用随机数字表法分为空白组、假手术组各20只；造模组60只，造模后再分为模型组、健侧针刺组、患侧针刺组；各组再分为3 d亚组和14 d亚组，各10只；其余40只备用。空白组、假手术组、模型组正常喂养3 d和14 d。健侧针刺组（即巨刺组）针刺人中、百会及健侧肢体曲池、合谷、足三里、三阴交行电针治疗；患侧针刺组针刺人中、百会及患侧肢体曲池、合谷、足三里、三阴交行电针治疗。取穴定位、针刺深度均参照中国针灸学会实验针灸研究会华兴邦等制定的《常用动物腧穴图谱》［3］。电针治疗波形选用疏密波，电流强度1 mA，以大鼠触须、耳朵微动为度，每次持续刺激30 min。在缺血再灌注24 h后行第1次电针治疗，每日1次。

1.5标本采集与检测每组大鼠分别于3 d和14 d行最后一次治疗后取材，深度麻醉后以预冷的0.9%氯化钠注射液左心室灌流冲洗，换经预冷的4%多聚甲醛固定，断头取脑，制备石蜡切片，取大脑皮质缺血区为观察部位，以相邻切片用于HE染色和免疫组化。HE染色后于400倍光镜下观测各组皮质区缺血脑组织形态学改变。免疫组化检测脑组织缺血区及周围VEGF、Ang-1的表达情况：免疫组化步骤按照试剂盒说明书进行操作。结果判定以胞浆染成棕黄色为阳性细胞。每例大鼠选3张切片，每张切片随机选3个视野进行摄像（400倍），用IPP6.0图像处理分析软件分别对VEGF、Ang-1的阳性细胞的平均光密度进行分析。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，均进行正态性、方差齐性检验，各组组间差异采用单因素方差分析，若方差齐时采用LSD检验，不服从正态性和（或）方差不齐时用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组脑组织常规病理染色结果见图1。空白组、假手术组大脑皮质：细胞层次整齐，结构完整，具有完整细胞核和丰富的胞浆，染色均匀。模型组大脑皮质：细胞数显著减少，细胞层次模糊、不完整，排列疏松，细胞形态肿胀不规则，梗死灶边缘可见坏死细胞。健侧针刺组：细胞数多于模型组，层次丰富，排列紧密，部分神经细胞完整，坏死细胞数量较模型组明显减少。患侧针刺组：与健侧针刺组比较，组织结构较疏松，间质稍见水肿，坏死细胞数量较健侧针刺组稍多。

图1　光镜下各组大鼠缺血脑组织结构（400倍）

2.2各组动物VEGF和Ang-1表达水平比较见表1。空白组、假手术组的脑缺血及周围组织均有少量VEGF和Ang-1表达，两者差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白组、假手术组相比，其他3组的VEGF、Ang-1表达均显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，健侧针刺组和患侧针刺组VEGF、Ang-1表达较前者上升（P＜0.05）；健侧针刺组与患侧针刺组相比，前者优于后者（P＜0.05）。

表1　各组大鼠3 d、14 d后大脑皮质VEGF、Ang-1蛋白表达的比较（±s）

表1　各组大鼠3 d、14 d后大脑皮质VEGF、Ang-1蛋白表达的比较（±s）

与空白组、假手术组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05；与健侧针刺组比较，☆P＜0.05。

组别n空白组10假手术组10模型组10健侧针刺组10患侧针刺组10 3 d亚组0.138±0.035 0.124±0.031 0.260±0.052△0.375±0.064△*0.316±0.066△*☆14 d亚组0.132±0.026 0.141±0.036 0.242±0.052△0.359±0.065△*0.298±0.063△*☆

3　讨论

“巨刺”首见于《内经》，属于九刺法之一。早在元代杜思敬的《济生拔粹·针经摘英集》就有关于巨刺治疗脑卒中的明确记载。中医学认为缺血性中风是由于气血瘀滞、脑脉痹阻、窍闭神匿、肌肤筋脉失于濡养，肢体失用所致。而巨刺法是运用全身经络系统相互沟通、联系的特点，通过刺激健侧经络，调动正气，借健侧经络间接达到疏通患侧气血，改善患侧肢体经络阻滞不通、针感较差、不容易得气的特点。因此，本实验以针刺健侧肢体作为实验组，以针刺患肢作对照。通过人中、百会醒脑调神导气；内关调理心神、疏通气血；曲池疏通肢体经络；足三里补虚健运、调和气血；三阴交补三阴、益肝肾、调气血。根据经络理论，人体经络系统是通过脏腑组织和奇经八脉相互沟通，且部分经络左右交叉。因此，左右侧经络在生理上是互相联系，在病理上是相互影响。现代解剖学同样可以为巨刺治疗中风偏瘫提供理论依据［4］。

缺血性脑血管病的现代医学治疗主要有超早期溶栓治疗、保护神经细胞，其目的在于尽快恢复血供和重建神经结构。而神经细胞的增殖并不是单独发生的，神经前体细胞的增殖与血管的生成密切相关。因此通过对血管再生的研究就可以大致了解和掌握神经元再生的情况。VEGF是已知的促进血管生长作用最强的细胞因子，VEGF/VEGFR系统激活使内皮细胞增生并诱导新生血管形成，增加受累脑组织再灌注及供氧量，从而减轻缺血再灌注损伤。Ang-1可以抑制血管内皮细胞的凋亡，减轻脑缺血后血脑屏障的渗漏从而减少梗死体积，促进血管内皮细胞的出芽与迁移。研究表明，针灸治疗缺血性脑病具有促进血管新生的作用［5］。因此，本研究以VEGF、Ang-1为检测指标。而局灶性脑缺血大鼠缺血脑组织VEGF在缺血第3日达高峰［6］。Ang-1于第14日达高峰［7］。故本实验分别于3 d和14 d检测缺血脑组织VEGF、Ang-1的表达水平。实验观察到，手术创伤对脑内血管内皮细胞VEGF及Ang-1的表达无明显影响；模型组VEGF及Ang-1的表达上升，说明脑缺血时，脑组织在一定程度上会自发性地出现血管新生，这与刘媛媛等的研究结果相一致［8］；健侧针刺组、患侧针刺组VEGF及Ang-1的表达均较模型组明显增多，而健侧针刺组较患侧针刺组明显，说明针刺可以改善脑缺血再灌注损伤大鼠缺血脑组织损伤程度，实现对脑缺血损伤的保护作用，而巨刺的效果更明显。巨刺可调节促血管生成相关因子，改善脑缺血后病侧脑的血液循环，通过促进内皮细胞增生并诱导内皮细胞迁移，新生血管形成，改善脑病灶及周围脑细胞的营养，从而改善缺血区脑组织的损伤程度。其作用可能是通过上调VEGF、Ang-1来实现的，这可能是巨刺治疗脑缺血再灌注损伤的机制之一。本实验结果与文献报道相符合［9］。但有文献报道VEGF也增加血管的通透性，可以导致脑水肿进而加重缺血性脑损害［10］。因此，巨刺的作用机制可能是多层次的，具体是哪些因子在起主导作用，又或是抑制了哪些细胞因子，有待进一步的研究。本研究提示了针刺与VEGF、Ang-1可能存在必然联系，从血管生成的角度初步探讨巨刺治疗缺血再灌注损伤的作用机制，为进一步探索巨刺的作用机制提供实验依据。

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Effects of Opposing Needling on the Expression of VEGF and Ang-1 in Brain Tissue in Rats with Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

SHI Xuehui，ZHANG Sulan，CAO Xia，et al.The Second Affiliated Hospital，Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410005，China

Objective：To observe the effects of opposing needling on the expression of VEGF and Ang-1 in brain tissue in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury and explore the possible mechanism of the opposing needling for treating rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods：One hundred SD male rats were randomly divided into the blank group，the sham-operated group，the model group，the unaffected-side acupuncture group（opposing needling group）and the affected-side acupuncture group，with twenty rats in each group.And groups were divided into 3d subgroup and 14d subgroup.The model of focal cerebral ischemia-reperfusion was established by inserting nylon thread into the internal carotid artery.Twenty-four hours after reperfusion，Unaffected-side acupuncture group，as well as Affected-side acupuncture group，was treated with"renzhong"，"baihui"and electro-acupuncture.Electro-acupuncture was chosen with constant stimulation of the density wave for thirty minutes every day.The ultrastructure of brain tissue on 3 rd and 14 th day after focal cerebral ischemia reperfusion was observed with the optical microscope.And the expression of VEGF and Ang-1 in cerebral cortex tissue was detected with immunehistochemical method.Results：The degree of ischemic brain tissue damage in rats was improved significantly after acupuncture.But the unaffected-side acupuncture group had an more obvious improvement than that of the affected-side acupuncture group.In comparison with the sham group，the expression of VEGF and Ang-1 in unaffected-side acupuncture group and affected-side acupuncture group increased significantly（P＜0.05）.And the expression of VEGF and Ang-1 in unaffected-side acupuncture group was more than that in the affected-side acupuncture group（P＜0.05）.Conclusion：Opposing needling can greatly improve the injury of ischemia reperfusion of brain tissue in rats，which may be related to its effect in up regulating VEGF an-d Ang-1 after the ischemia-reperfusion injury.

Opposing needling；Ischemia-reperfusion；VEGF；Ang-1；Brain tissue

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1525-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.007

2015-04-22）

湖南省科技计划项目（S2014S2033）

（电子邮箱：1617564871@qq.com）