冠心病心绞痛标志物的液质非标记筛查比较

苗 兰曹进,2* 孙明谦林 力张 颖刘建勋

（1 中国中医科学院西苑医院，基础医学研究所，中药药理北京市重点实验室，北京100091；2 中国食品药品检定研究院，食品化妆品检定所，北京100050）

冠心病心绞痛标志物的液质非标记筛查比较

苗 兰1曹进1,2* 孙明谦1林 力1张 颖1刘建勋1

（1 中国中医科学院西苑医院，基础医学研究所，中药药理北京市重点实验室，北京100091；2 中国食品药品检定研究院，食品化妆品检定所，北京100050）

目的 通过非标记技术对血清中心绞痛蛋白标志物进行筛查。方法 利用液相色谱质谱技术进行血清中蛋白酶解产物的分离测定，分别测定健康组、疾病零点（0时点）和两周三组的样本，通过蛋白搜索比较获得相关结果。结果 健康组、0时点、2周的总蛋白数分别为466个、449个、483个，共有蛋白319个，比较发现血清蛋白组的差异不仅表现在蛋白种类的不同，还在于共有蛋白在整个蛋白组中的分布和相对含量的差异，通过相对量的比较，存在18个主要差异蛋白，其中13个蛋白呈上调趋势，5个呈下调趋势。结论 在疾病发生过程中，主要的蛋白变化多与心脏损伤方面的过程相关，随着疾病进程，由于自身适应的作用，有部分与修复相关的蛋白有明显的变化，该结果可以为心绞痛潜在标志物的选择提供数据基础。

非标记；蛋白组；液相色谱质谱；心绞痛

传统的心血管疾病长期依赖于流行病学研究来鉴别和判断疾病产生中诊断性和预测性的风险因素，如高血脂、高血压、精神压力等。在临床诊断中主要依靠对患者的一些病理生理及生化检查结果进行疾病的判断。20世纪90年代末，针对冠心病中比较常见的临床分型，部分内源性标志物的测定就被纳入国外一些诊断标准[1]中来辅助诊断疾病，如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α等做为急性冠状动脉综合征前炎症阶段的辅助诊断标志物。但是对于心肌梗死早期，心肌梗死预测等的标志物还处于研究和未知阶段，特别对于低含量的蛋白，代谢物和肽尚处于发现鉴别阶段，对于心肌梗死的潜在早期（2 h以内）诊断标志物发现仍是心肌梗死诊疗研究的热点[2-5]。

作为理想的心肌梗死标志物在针对性低成本筛查中必须具备高的灵敏度、专属性和相关症状正面的预测性。标志物本身可以显示疾病和健康的特征，包括表达水平、相关环境因子的种类、遗传性质、遗传反映、临床显证或者不显证的标记、病因及对治疗的反应等。因此，标志物是疾病特性，状态及发展速度的指针。

自蛋白质组学发展以来，心脏病标志物的研究主要是针对血清样本的研究[6-8]，通过应用二维凝胶技术和质谱的蛋白鉴别发现了一些标志物，然而，这种技术方法本身的一些局限性，如灵敏度、重复性及动态范围等，影响了其被广泛应用。近年来，Yates等[9]提供了一种利用谱图的累积计数来鉴别蛋白的非标记方法，由于其在技术上克服了同位素标签技术操作复杂、数据分析耗时的缺点，因而，这种研究技术逐渐成为研究的主流方向。针对非标记的LC/MS组学技术一个主要的问题是组织的异常复杂影响了丰度结果可鉴别程度，因此，准确、简便、系统、规范的样品预处理过程是整个分析测定的基础。在本研究中，我们应用非标记液相色谱/质谱联用技术，以冠心病心绞痛显证患者血清样品为研究对象，应用建立的一整套蛋白处理、蛋白组分析、鉴定等优化流程[10]，对冠心病心绞痛发展的不同时点的血清样本进行蛋白质组学的比较研究，从整体、微观层次动态的研究冠心病心绞痛特有蛋白质的表达，寻找冠心病心绞痛相关的差异标志物，以帮助临床治疗对于疾病进程的判断。

1　材料与方法

图1　人健康组与疾病组血清蛋白组PLS-DA（左图）和OPLS-DA（右图）图（红色：健康组；蓝色：疾病0时点；紫色：疾病2周）

图2　检出蛋白所涉及的生物学过程和分子功能（左图：生物学过程；右图：分子功能）

1.1仪器与试剂。仪器：质谱仪（Agilent，6520 Q-TOF，Chip-ESI源）；纳升级液相色谱（Agilent 1200，Chip），色谱工作站（Agilent，USA）；电子分析天平（METTLER TOLEDO AE240）；注射泵（KD Scientific公司，KDS100CE）；蛋白芯片Chip C18，150 mm×75 μm（Agilent，USA）。试剂：三羟甲基氨基甲烷Tris（amresco公司，批号2118B172），TCEP（Thermo公司，批号KG133033）、胰蛋白酶Trypsin（Thermo公司，批号KG133767），乙腈（Fisher，批号138939）、丙酮（J.T.Braker公司，批号G43E31），均为色谱纯，甲酸（J.T.Braker公司，批号1K2732），为分析纯，实验用水（娃哈哈纯净水，批号201311281117GQ）。

1.2临床样本收集与样本处理。样品的收集：依据临床实验采集方案，选取30例健康人，30例显证冠心病心绞痛患者，自患者和健康人入组后采集一次静脉血液（0时点），2周后再采集一次（进行自身对比，2周）。每次取血5 mL，4 ℃放置30 min，离心15 min（3500 r/min，4 ℃），取上清，-80 ℃保存。应用BCA法测定蛋白浓度。样本处理：吸取50 μL血清，加入3倍体积Tris缓冲液（50 mmol/L），涡旋1 min，加入3倍体积预冷丙酮，涡旋1 min，4 ℃沉淀过夜，离心15 min（8000 r/min，4 ℃），弃上清，使沉淀中的丙酮挥发完全。

1.3蛋白酶解：将提取的蛋白混悬于50 mmol/L tris缓冲液中（pH 8.5），蛋白浓度约1～3 mg/mL；活化胰蛋白酶（Trypsin）（50 mmol/L tris溶液），以20∶1的比例加入酶液，37 ℃水浴3 h，每1 h涡旋1次；加入1 mmol/L TCEP，37 ℃水浴30 min，放冷至室温；每10 μg蛋白加入3 μL IAA溶液进行烷基化，37 ℃水浴20 min（避光）；以30∶1的比例加入酶液，37 ℃水浴过夜；每50 μL溶液加入2 μL甲酸终止反应；离心15 min（12000 r/min，4 ℃），取上清进行分析。

1.4质谱与色谱条件。质谱参数设置，源：ESI-Chip；阳离子模式；毛细管电压：-1900 V；干燥气温度325 ℃；干燥气流量：3.5 L/min；碎裂电压：200 V；锥孔电压：75 V；射频电压：700 V；质量范围：300～1700 m/z；MS/MS 碎裂放大电压：1 V；离子排除：7个前体离子；排除时间30 s。

色谱条件：蛋白芯片：150 mm 300A C18chipw/160nL富集柱；进样量：0.5 μL；泵1（纳升泵）流动相：A相：97%水，3%乙腈，0.1%甲酸；B相：90%乙腈，10%水，0.1%甲酸；流速：0.3 µL/min；线性梯度洗脱时间：B相0～70 min，3%～45%；70～85 min，45%～90%；85～95.01 min，90%～100%；95.01～110 min，100%；110～115 min，100%～3%；115～125 min，3%；运行时间：125 min。泵2（毛细泵）流动相：A相：0.1%甲酸水溶液；B相：90%乙腈，10%水，0.1%甲酸；流速：3 µL/min；线性梯度洗脱时间：B相0～4 min，0%；4～5 min，0%～80%；5～10 min，80%；10.01～85 min，80%，流速0 µL/min；85.01～95 min，80%～100%，流速3 µL/min，95～96 min， 100%～0%；运行时间：125 min。

1.5数据检索与分析：应用Agilent DataAnalysis软件进行图谱分析；应用Excel2010及SPSS12.0统计分析软件进行数据的统计学分析。蛋白检索应用的是Agilent Spectrum Mill软件。参数设置：数据库种类：Swissprot；种属：Homo sapiens；消化：Trypsin（胰酶）；最大酶切偏差：1；固定修饰：Carbamidomethylation（C）；前体质量数偏差：+/-20 ppm；产物质量偏差：+/-50 ppm；多肽过滤得分＞6，SPI（峰丰度）＞50%；蛋白过滤得分＞9。

1.6蛋白相对定量和功能聚类分析：应用scaffold3.0软件进行蛋白相对定量、差异分析及蛋白功能聚类分析。在进行蛋白相对定量时，要求肽段鉴定的可能性＞95%，蛋白鉴定的可能性＞99%，且匹配肽段2个以上，假阳性率＜0.01%。相对定量的原理是累计谱图计数，即利用鉴定到的二级质谱图总数评价特定蛋白的丰度，对不同分组中的同一蛋白所检测到的二级谱图的个数进行归一化，再比较蛋白的相对丰度。统计学方法应用的是ANOVA Test方法。同时应用软件中GO注释的功能进行蛋白质功能聚类分析。

2　结果与讨论

2.1冠心病心绞痛患者血清整体蛋白的发现：通过应用非标记LC-MS技术进行冠心病心绞痛不同时期（0时点，2周）与健康组血清蛋白组的检测，结合软件进行搜索比对和分析，最终比对出健康组、0时点、2周的总蛋白数分别为466个、449个、483个，共有蛋白319个。对于共有的319个蛋白利用累积计数的方式，进行相对量比较，表达量下降的蛋白，下降比例均小于7倍，而表达量上升的部分蛋白，表达量变化差异可达62倍。

结果显示随着疾病的进程，疾病与正常人群之间蛋白组在量上存在较大的差异，在疾病发病后，疾病相关的部分蛋白组存在上调的趋势，同时根据疾病进程，存在进一步扩展的趋势。

2.2血清蛋白组最小二乘法与偏最小二乘法分析：针对最终检索出的蛋白，应用SIMCA P+12.0软件进行组学数据的聚类和预测分析。以健康组为参照，对另2组（0点和2周）疾病来源样品进行了最小二乘法（PLS-DA）和偏最小二乘法（OPLS-DA）分析，将上述各组进行分类。见图1，两图均显示健康组和疾病组（0点，2周）区分较为明显，表明疾病组和健康组变化差异较大；而疾病0点和2周的数据点不能明显区分开来，具体走势不明显，表示疾病0点和2周疾病发展变化可能不大。

2.3蛋白功能分析：本研究针对检测到的蛋白相关的生物学过程和分子功能进行聚类分析。见图2所示，鉴定到的蛋白涉及的生物学过程主要是应激反应、生物调控反应、代谢过程、细胞过程、免疫系统过程等；其涉及的功能主要是分子信号转导活性、结合功能、酶调控活性、分子功能及催化活性等。分析结果显示的主要生物学过程和分子功能与心绞痛的发生、发展有着密切的关系，也与之前的研究结果一致。

2.4差异蛋白及其功能分析：本研究中应用非标记的蛋白质组学方法，结合Scaffold软件进行蛋白相对定量分析，根据蛋白整体的含量水平差异，蛋白差异变化在10倍以上的被视为差异蛋白。经比较分析发现的差异蛋白18个，与正常组比较，疾病组中有13个蛋白上调，有5个蛋白下调，这些差异蛋白多与炎性反应、血栓形成、动脉粥样斑块、缺血/再灌损伤及血小板功能等方面相关。

在上述差异蛋白中，表达量上调的蛋白其功能主要与介导炎性反应、动脉血栓形成、调节血管再生、调节内皮细胞黏附及血小板凝集等过程相关。这些来自炎症、心肌缺血或心脏病相关的蛋白，在急性心肌梗死、心阻甚至慢性缺血的情况下，会引起一系列炎性因子的释放，同时细胞黏附分子激活，能够进一步使血管收缩狭窄，引起血管的堵塞，造成心肌缺血。C-反应蛋白是已知的、公认的急性炎性反应期的临床诊断标志物，能够反映心血管疾病发生发展的不同阶段。其次，这些调节血管再生和凝血蛋白能够直接影响心绞痛的发生、发展与转归，如在慢性心肌缺血状态下，发生血管再生能够暂时缓解心肌缺血的症状，为进一步治疗赢得时间，随着导致心肌缺血的原因消除，血管心脏功能渐趋好转，但是如果病情日渐恶化，主干血管发生严重堵塞，血管再生根本无法满足心脏的供血需求，最终导致心衰。因此，炎性反应的发生、血栓的形成、动脉粥样斑块的形成、细胞的黏附、血管的调节等均是心绞痛发生发展的影响因素，或者说是始动因素，可以间接或者直接导致心绞痛的发生和发展。

而在表达量下调的蛋白中主要是生长与分化相关蛋白、心脏重塑相关蛋白及心肌肥大相关蛋白等，说明心脏发生缺血后会启动代偿机制，触发自我修复的能力，只是根据患者的身体状况和疾病发展的不同进程，其代偿能力、自我修复能力及修复程度不同。该类蛋白随着血液循环接触相关细胞，对细胞的生长过程产生影响，如类胰岛素样生长因子（IGF-1），是一类多功能细胞增殖调控因子，其结构与胰岛素结构相似，可以触发与胰岛素相似的细胞反应，包括细胞的分化、增殖。

2.5结论：本研究应用非标记LC-MS方法对心绞痛疾病和健康人的临床血清样本进行蛋白质组分析比较，通过检测、数据比对以及相对定量分析，发现了18个与疾病相关的主要差异蛋白，其中13个蛋白存在上调的趋势，这些上调蛋白根据主要的功能集中在炎症、心肌缺血或心脏疾病标志物、血管蛋白；而5个下调的差异蛋白主要是心衰与重塑相关蛋白，说明在心绞痛发展的进程中，存在自身的调节，以弥补来自炎症或者缺血带来的心脏损伤。

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Markers Screening on Coronary Heart Disease Angina Pectoris by Label free Liquid Chromatography Mass Spectrometry

MIAO Lan1, CAO Jin1,2, SUN Ming-qian1, LIN Li1, ZHANG Ying1,Liu Jian-xun1
(1 Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing Key Laboratory of Chinese Materia Pharmacology, Beijing 100091, China; 2 National Institute of Food and Drug Control, Institute for Food and Cosmetics Control, Beijing 100050, China)

Objective To screen protein markers of angina pectoris in serum by label free technology. Method Liquid chromatography mass spectrometry was performed to separate and detect the digestion products in three groups’s ample, which were healthy, disease zero point(0 week), and two weeks point(2 weeks). The comparison results were achieved by database searching. Results The total proteins in three groups, healthy, disease zero point(0 week), and two weeks point(2 weeks), were 466, 449, and 483, respectively. The common proteins were 319. The difference between serum proteome in different groups was not manifested around the types of protein but in distribution and relative amount across proteome. With the comparison of relative amount, 13 proteins were presented in uptrend as well as 5 in down trend. Conclusion The results shown the difference proteins in serum were varied with the process of cardiac trauma. Along the development of disease， proteins related with repair had been varied significantly through self adaptive. The results could provide the basis data for potential biomarkers option on angina pectoris

Label free; Proteome; Liquid chromatography mass spectrometry; Angina pectoris

R541.4

B

1671-8194（2015）36-0004-03

科技部国际合作项目（2011DFA31440）；中国中医科学院西苑医院苗圃课题（XYKY-MP（2013）-34）；北京市科技专项（z121107002812036）