固相萃取-LC-MS/MS同时测定牛奶中7种β2-受体激动剂

马立利，刘艳，贾丽，冯月超，张春梅，范筱京

（北京市理化分析测试中心，北京市食品安全分析测试工程技术研究中心，北京100089）

固相萃取-LC-MS/MS同时测定牛奶中7种β2-受体激动剂

马立利，刘艳*，贾丽，冯月超，张春梅，范筱京

（北京市理化分析测试中心，北京市食品安全分析测试工程技术研究中心，北京100089）

建立了牛奶中7种β2-受体激动剂残留量超高效液相色谱/串联质谱的分析方法。牛奶样品经40%甲醇溶液提取、乙酸锌溶液蛋白沉淀、HLB固相萃取柱净化后，以C18为分析色谱柱，甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相进行梯度洗脱分离，采用多反应监测（MRM）模式测定。结果表明，7种β2-受体激动剂在0.04 μg/kg～4 μg/kg的浓度范围内呈线性，其相关系数r2大于0.998，定量限在0.01 μg/kg～0.04 μg/kg，加标回收率为66.8%～99.2%，相对标准偏差（RSD）范围为2.0%～15.8%。本方法灵敏度高，准确度好，对实际样品进行了测试分析，均获得了满意的结果。

β2-受体激动剂；牛奶；超高效液相色谱/串联质谱

β2-受体激动剂是一类化学合成的苯乙醇胺类衍生物，它们的结构跟天然分泌的多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素的结构相似。1988年，β2-受体激动剂被批准用于医疗和兽医治疗，主要用于防治哮喘、支气管痉挛等疾病［1］。这类物质能够促进蛋白沉淀［2］，具有营养重新分配和提高瘦肉率的作用，被广泛用做食品动物生产中的促生长添加剂［3-5］。然而，人体累计摄入此类药物剂量超过一定值或食入高残留量的内脏组织后，易出现毒副作用，如肌肉震颤、剧烈腹痛、心跳和呼吸加快等，对人体危害巨大［6］。因此，中国和欧盟都规定所有的β2-受体激动剂在动物饲养过程中严禁使用［7］。

农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定在所有食用动物的所有可食组织中不得检出此类药物。欧盟、美国、日本等发达国家对动物性食品中克伦特罗和莱克多巴胺残留制定了严格的限量要求，如欧盟规定牛奶中克伦特罗残留量不得超过0.05 μg/kg。我们国家严格禁止将该类药物给动物使用，并要求动物性食品中不得检出［7-8］。

β2-受体激动剂在动物源食品中检测方法较多。目前，国内外报道的确证方法主要有气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS/ MS）等［9］。GC-MS法通常需要酰化、硼化，或三甲基硅烷化等复杂的衍生步骤，并且目前还未有一种衍生化试剂对所有的β2-受体激动剂有效；在衍生化过程中，还会产生其他的副产物，对目标物的定量分析有一定干扰［10］。而LC-MS/MS检出限较低，灵敏度较高，可以准确定性，现在已成为检测此类物质的首选［11］。本文通过简化前处理步骤，结合UPLC-MS/MS，建立了牛奶中7种β2-受体激动剂进行的检测方法，方法具有简单、高通量的特点，满足残留分析的要求。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

UPLC-MS/MS，配备有ACQUITY超高效液相色谱仪、Xevo TQ-S串联四级杆质谱仪：Waters公司；HY-5回旋式振荡器：江苏金坛市宏华仪器厂；涡旋仪：江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；Elix 10 Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；固相萃取装置：美国Agilent公司；高速冷冻离心机（Hitachi，CR22GⅢ）；恒温水浴氮吹仪，包括N-EVAPTM112氮气蒸发仪、OA-SYSTM加热装置：Organomation Associates公司；ACQUITY UPLCBEHC18色谱柱（2.1×50mm，1.7μm，Waters公司）；HLB固相萃取住（Waters Oasis，500mg/6 mL）；0.22 μm微孔滤膜：天津津腾科技有限公司。

溴布特罗（Brombuterol）、富马酸福莫特罗（Formoterol fumarate dihydrate）、马贲特罗（Mapenterol）、盐酸马布特罗（Mabuterol hydrochloride）、盐酸莱克多巴胺（Ractopamine hydrochloride）、盐酸克伦特罗（Clenbuterol hydrochloride）、盐酸妥布特罗（Tulobuterol hydrochloride）标准品（非盐形式结构见图1）购于Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；乙酸锌、亚铁氰化钾（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2样品处理

1.2.1样品提取

图1　β2-受体激动剂的结构式Fig.1Chemical structures of β2-agonists

准确称取5 g牛奶样品于50 mL塑料离心管中，加入15 mL 40%甲醇溶液，涡旋1 min，振荡提取30 min。加0.5 mL乙酸锌溶液（21.6 g/100 mL），涡旋1 min，10 000 r/min离心10 min，转移至另一离心管中，再加15 mL 40%甲醇溶液溶解残渣，涡旋1 min，振荡提取20 min，10 000 r/min离心10 min。合并提取液，待净化。

1.2.2样品净化

将HLB固相萃取小柱放入固相萃取装置的指定位置，依次用6mL甲醇、6mL水活化。取提取液全部过柱，用3 mL 5%甲醇溶液淋洗，6 mL甲醇洗脱至10 mL离心管中。在氮吹浓缩装置上于50℃吹干，用甲醇-0.1%甲酸溶液（体积比为1∶9）定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜后待测。

1.3仪器分析条件

1.3.1液相色谱条件

柱温：30℃；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸溶液；二元梯度分离，梯度顺序：0 min～5min，95%～70%B；5 min～9 min，70%～10%B；9min～10min，10%～95%B；10min～12 min，95%B。

1.3.2质谱条件

电喷雾电离（ESI+）离子源；源温为150℃；毛细管电压3.2 kV；脱溶剂温度500℃；脱溶剂气（氮气）流量为900 L/Hr。7种目标物的采集参数列于表1。

表1　β2-受体激动剂的质谱采集条件Table 1Optimization conditions of β2-agonists in mass spectrometric analysis

续表1β2-受体激动剂的质谱采集条件Continue table 1Optimization conditions of β2-agonists in mass spectrometric analysis

2结果与讨论

2.1质谱与色谱条件的优化

2.1.1液相分离条件的优化

本实验考察了不同溶剂的分离效果，包括甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵、甲醇-5 mmol/L乙酸铵、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸7种流动相对分析物的分离度和响应值的影响。最终确认甲醇-0.1%甲酸体系具有比较理想的分离度和响应值。

考察了不同的定容溶剂：甲醇-0.1%甲酸（10∶90）、甲醇-水（10∶90）、甲醇。其中甲醇-水中目标物的响应值与甲醇-0.1%甲酸无明显区别，但是后者的峰形比前者更对称；选用甲醇为溶剂时，响应值较低。因此，最终选择甲醇-0.1%甲酸（10∶90）为定容溶剂，使目标具有良好的响应值和峰形，具体色谱图如图2所示。

图2　7种β2-受体激动剂的色谱图Fig.2Chromatography of β2-agonists

2.1.2质谱条件的确定

由于所购标准品为马布特罗、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗几种受体激动剂的盐酸盐形式，调谐时，母离子应为［M-HCl+H］+。富马酸福莫特罗为富马酸盐，母离子为［1/2［M-fumaric-2H2O］+H］+。

2.2提取与净化条件的优化

2.2.1提取条件的优化

提取溶剂对提取效果有一定的影响。本实验中，准确称取5 g牛奶样品，加标水平为1 μg/kg，分别考察10%、20%、30%、40%甲醇溶液提取效率，见图3。

采用40%甲醇溶液提取时6种分析物的回收率较其他3种溶剂高；妥布特罗回收率较低。加入0.5 mL乙酸锌溶液沉淀，10%甲醇溶液提取离心后有少量蛋白漂浮，甲醇含量越小，沉淀效果越差。定容过膜后，40%甲醇溶液提取的颜色最浅，其他呈淡黄色。因此，综合考虑，选用40%甲醇溶液作为提取溶剂。

2.2.2沉淀溶剂及体积的优化

当选用40%甲醇溶液提取，经10 000 r/min离心10 min后，体系中仍有大量蛋白质。考虑到乙酸锌和亚铁氰化钾具有沉淀蛋白的作用［12］，本实验分别考察了不同体积的乙酸锌溶液（21.6 g/100 mL）、亚铁氰化钾溶液（10.6 g/100 mL）的沉淀效果：0.5、1.0 mL和2.0 mL乙酸锌溶液、0.5、1.0 mL和2.0 mL亚铁氰化钾溶液，以及1.0 mL乙酸锌溶液和1.0 mL亚铁氰化钾溶液的混合溶液被考察。结果表明，3种只加亚铁氰化钾溶液方式，样品处理液仍然十分浑浊，蛋白沉淀效果较差；而加入乙酸锌溶液效果良好，加入0.5 mL就能达到要求。因此，本实验采用0.5 mL乙酸锌溶液沉淀体系中的蛋白质。

2.3分析方法的评价

2.3.1基质效应

基质是样品中被分析物以外的组分，常对目标物的分析有显著干扰，并影响结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应。串联质谱以特异性强著称，但越来越多的数据表明质谱检测同样需要注意避免基质效应。

基质效应可影响检出限（LOD）、定量下限（LOQ）、线性、准确度和精密度。Matuszewski等［13］首次提出可以对基质效应的强度进行定量的评价方法，分别测定提取后添加目标物与流动相中添加同样浓度目标物的离子响应强度，计算二者相对比值来评价基质效应。若比值小于1.0，说明基质的存在对目标物的响应产生了抑制作用；若大于1.0，说明基质对目标物的响应产生增强作用；若等于1.0，说明不存在基质效应，但在实际中，很难得到这样的结果，一般相对比值在0.85～1.15之间则认为基质效应不明显［14-15］。

参照Du等［3］对基质效应的评价，利用基质标准曲线对溶剂标准曲线斜率的比值，评价本方法的基质效应。7种分析物的斜率之比为0.836～1.112（见表2），除马贲特罗（0.836）外，本方法对对其他6种β2-受体激动剂基质效应不明显；而牛奶基质对马贲特罗的响应有一定的抑制作用，由于差别不是很大，综合其他目标物的结果，7种待测物利用溶剂标准曲线定量。

表2　基质标准曲线和溶剂标准曲线的比较Table 2Comparison of matrix-matched calibration and solvent calibration

2.3.2方法的定量限及回收率

方法的LOQ按照实际检测的样品峰高与噪音的峰高比S/N>10计算。并在最佳提取条件和色谱条件下，考察了3个不同加标浓度（0.04、0.2、2 μg/kg）牛奶样品的回收率。方法的LOQ、回收率和相对标准偏差结果见表3。

2.4样品分析

将市场上购买的10份牛奶样品，在最优提取条件下进行处理，并通过超高效液相色谱/串联质谱进行分析，所有牛奶样品均未检出目标物。

表3　β2-受体激动剂的定量限、3个添加水平的回收率和相对标准偏差Table 3LOQ，recoveries and RSD for target compounds from milk in three spiked levels

3结论

本研究建立了牛奶中7种β2-受体激动剂残留的固相萃取-超高效液相色谱/串联质谱测定方法。采用40%甲醇溶液提取，乙酸锌溶液沉淀蛋白，HLB固相萃取柱净化。分析过程中只用了甲醇和甲酸两种有机溶剂，具有绿色环保、处理简单、提取效率高等优点，能够满足牛奶中β2-受体激动剂残留快速检测的特点。

［1］Ramos F J D.β-Agonist extraction procedures for chromatographic analysis［J］.J Chromatogr A，2000，880：69-83

［2］Juan C，Igualada C，Moragues F，et al.Development and validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the analysis of β-agonists in animal feed and drinking water［J］.J Chromatogr A，2010，1217：6061-6068

［3］Du X D，Wu Y L，Yang H J，et al.Simultaneous determination of 10β2-agonists in swine urine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and multi-walled carbon nanotubes as a reversed dispersive solid phase extraction sorbent［J］.J Chromatogr A，2012，1260：25-32

［4］刘敏，刘戎，王立琦，等.猪肝中β-受体激动剂多残留的样品前处理方法比较及同时检测［J］.分析测试学报，2012，31（3）：290-295

［5］金玉娥，郭德华，郑烨，等.液质联用仪测定动物源性食品中11种β2-受体激动剂的研究［J］.质谱学报，2007，28（4）：193-201

［6］白凌，陈大舟，李蕾.液相色谱-质谱法检测肝脏中5种β-受体激动剂［J］.质谱学报，2008，29（1）：10-12

［7］Li C，Wu Y L，Yang T，et al.Simultaneous determination of clenbuterol，salbutamol and ractopamine in milk by reversed-phase liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution［J］.J Chromatogr A，2010，1217：7873-7877

［8］沈建忠，江海洋.畜产品中β-受体激动剂残留及其危害［J］.中国动物检疫，2011，28（6）：27-28

［9］孙雷，张骊，朱永林，等.超高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中残留的9种β-受体激动剂［J］.色谱，2008，26（6）：709-713

［10］Lee H B，Sarafin K，Peart T E.Determination of β-blockers and β2-agonists in sewage by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2007，1148：158-167

［11］李莹莹，宋永青，郭文萍，等.超高效液相色谱-串联质谱方法同时测定猪肉中7种β-受体激动剂残留量［J］.肉类研究，2012，26（5）：25-29

［12］中华人民共和国卫生部.GB 21703-2010乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的测定［S］.北京：中国标准出版社，2010：1-4

［13］Matuszew S K，Constanzer M L，Chavez-eng C M.Strategies for the assessment of matrix effect inquantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS［J］.Anal Chem，2003（75）：3019-3030

［14］王立琦，曾振灵，束建花，等.液相色谱-电喷雾串联质谱测定猪组织中β-兴奋剂残留的基质效应［J］.分析化学研究简报，2012，40（9）：1445-1449

［15］王立琦，贺利民，曾振灵，等.液相色谱-串联质谱检测兽药残留中的基质效应研究进展［J］.质谱学报，2011，32（6）：321-332

Solid Phase Extraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for the Determination of 7 β2-agonists in Milk

MA Li-li，LIU Yan*，JIA Li，FENG Yue-chao，ZHANG Chun-mei，FAN Xiao-jing
（Beijing Center for Physical and Chemical Analysis，Beijing Engineering Research Center of Food Safety Analysis，Beijing 100089，China）

A simple and inexpensive pretreatment procedure was developed for 7 β2-agonists（brombuterol，formoterol，mapenterol，mabuterol，ractopamine，clenbuterol，tulobuterol）in milk.The samples were extracted with 40%methanol in water，and then Oasis HLB solid phase extraction（SPE）cartridges were used for cleanup.The analytes were quantified by ultra performance liquid chromatography coupled with electrospray ionisation tandem mass spectrometry（UPLC-ESI-MS/MS）operating in positive multiple-reaction mode（MRM）.Competent linearity was found for all target compounds with linear regression coefficients（R2）higher than 0.998.The limit of quantification ranged from 0.01 μg/kg to 0.04 μg/kg.Average recoveries spiked into raw milk were in the range from 66.8%to 99.2%with associated RSD values from 2.0%to 15.8%under the selected conditions.The method is rapid，cost-effective and can meet the requirements for identification and quantification of the β2-agonists in milk．

β2-agonists；milk；UPLC-MS/MS

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.022

2014-02-20

北京市优秀人才计划（No.2011D002022000005）；北京市科学技术研究院市级财政项目（PXM2014_178305_000008）

马立利（1981—），女（汉），助理研究员，硕士，研究方向：食品分析与检测技术。