藏茴香水溶性抑菌活性成分的分离与纯化研究

王树林，王蕊，王秀玉

（青海大学农牧学院，青海西宁810016）

藏茴香水溶性抑菌活性成分的分离与纯化研究

王树林，王蕊，王秀玉

（青海大学农牧学院，青海西宁810016）

以单因素和正交试验优化了AB-8大孔树脂纯化藏茴香种子水溶性抗菌活性成分的工艺，并进行抑菌活性验证；结果表明吸附时间为8 h，加入样液3 BV的水稀释样液，用50%乙醇做洗脱剂洗脱得到的抗菌成分抑菌效果最好，采用优化工艺能够快速高效分离纯化藏茴香水溶性抑菌成分，且纯化成分具有较好地抑菌效果。

藏茴香；水溶性；抗菌成分；纯化

藏茴香（Caraway）是伞形科葛缕子属植物，该植物为多年生草本植物，在亚洲、欧洲、北美洲和北非洲等地均有分布。在我国主要分布在东北、华北、西北、四川、青海、西藏等地。其生长条件对土壤，环境要求不严格。生长于海拔400 m～800 m的路旁，草原，山沟，河滩及山坡等处［1-3］。它不仅是重要的中藏药材，也是重要的香料及蔬菜资源［4］。在欧洲自古以来将其作为芳香性驱风药和香料使用，藏茴香也具有祛胀气，助消化的作用。其药用价值在我国传统中药和藏药典籍中均有记载，藏茴香的根，种子入药具有祛风除湿，治感冒，关节疼，平喘，明目，利胆，抑菌，杀真菌等功效［2］。近年来，藏茴香人工种植技术不断成熟，藏茴香资源日益增加。青海藏茴香资源具有产量高，分布广及无污染等特点，同时有易采集，成本低，便于开发利用等优点。因此研究藏茴香在食品，药品领域的应用将极大地提高该植物资源种植的经济效益，为广大农牧民开展特色种植，提高经济收入开拓新渠道。

藏茴香的精油是强力杀菌剂，能治痉挛，杀真菌［4］。将藏茴香种子用水蒸气蒸馏法提取精油，其蒸煮液中存在的活性成分，也具有抑菌杀菌活性。将藏茴香水煮液经分离并纯化，预期可分离得到具有抑菌特性的活性成分。茴香水溶性成分主要有单萜，单萜葡糖苷，羟基葡糖苷，芳香化合物，糖族化合物等［5］。藏茴香水提液中具有抑菌特性的成分有羟基麝香草酚及糖苷［6］。大孔吸附树脂技术是以大孔吸附树脂为吸附剂，利用其对不同成分的选择吸附和筛选作用，通过适宜的吸附和解析条件借以分离纯化某一种或某一类有机化合物的技术。该技术具有吸附快，解析率高，吸附容量大，洗脱率高，树脂可再生等优点，因此被广泛的运用于天然产物的分离纯化［7］。

伴随着人们绿色，健康意识的不断增强，安全、绿色、天然、植物源的消杀产品市场需求不断增长［8-9］。本研究以微生物平板培养-打孔法［10-11］验证藏茴香水溶性活性成分的抗菌活性，以单因素和正交试验优化水溶性活性成分分离纯化工艺，以期为藏茴香开发、加工消杀产品与应用提供必要的试验参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料

1.1.1.1藏茴香种子

购自青海省乐都县。

1.1.1.2试剂

蒸馏水、无水乙醇（分析纯）：天津市河东区红岩试剂厂；AB-8大孔吸附树脂：天津波鸿树脂科技有限公司。

1.1.2供试菌种及培养基

大肠杆菌菌种：青海大学农牧学院微生物实验室提供。

营养琼脂（BR）：北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠（AR）：天津市致远化学试剂有限公司；培养皿、打孔器、接种环。

1.2仪器与设备

FZ102微型植物粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；RE-2000B旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂；TGL20MN台式大容量高速冷冻离心机：湖南郝西仪器装备有限公司；DK-98-11电子万用炉：天津市泰斯特仪器有限公司；JM-B2003电子天平：诸暨市超泽衡仪器设备有限公司；LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DHG-9070A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；WDP-450电热恒温培养箱：上海安亭科学仪器有限公司；THZ-82恒温振荡器：国华企业；Z型层析柱：上海精科实业有限公司；SW-CJ-1D型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；镀铬游标卡尺：佳木斯计量仪器实验厂。

1.3试验方法

1.3.1藏茴香水溶性活性成分样液的制备

称取已粉碎的藏茴香种子50 g，加10 BV水，浸泡1 h，蒸馏3 h，除去精油。收集剩下的蒸煮液，得到藏茴香水溶性成份粗取液。将粗提液离心（5 000 r/min，15 min）除去肉眼可见的杂质后，旋转蒸发浓缩（温度为40℃，压力为0.065 MPa）约10倍，制得藏茴香水溶性活性成分提取液，冷藏备用。

1.3.2藏茴香种子中水溶性活性成分分离纯化工艺流程

将1.3.1项制得的提取液与已处理好的AB-8大孔吸附树脂以一定体积比混匀，装入100 mL三角瓶中，放入恒温水浴振荡器中震荡吸附，使其达到饱和吸附。用滤纸过滤吸附好的树脂，并将树脂湿法上层析柱。藏茴香种子水提液中主要的抗菌成分有麝香草酚及糖苷，酚类物质显弱酸性，当上样液pH偏大时，活性成分不易吸附。样液制备好后，测得样液pH为 4.87，显弱酸性，因此此处可忽略pH对分离纯化效果的影响。合适的径高比可为解析提供较好的效果，若径高比太小，会因为洗脱剂与吸附饱和的树脂接触面积不足或洗脱剂量不足而影响解析率，因此此处确定径高比为1.5∶20。洗脱流速太快时，活性成分不易解析，因此解析流速应控制在3 mL/min～4 mL/min。

上柱完成后，先以100 mL蒸馏水洗脱杂质（以3 mL/min～4 mL/min流速洗脱），然后以乙醇100 mL为洗脱剂进行解析（以3 mL/min～4 mL/min流速），并收集洗脱液。将收集液放入烘箱低温（40℃～50℃）干燥，所得干物质加入1.0 mL蒸馏水溶解，即得纯化的活性部分。其工艺流如图1所示。

图1　藏茴香水溶性活性成分分离纯化工艺流程Fig.1Flow of separation and purification about water soluble active ingredient from caraway

1.3.3培养基的制备及抑菌试验方法

采用打孔法［10］测定抑菌圈直径来衡量抑菌活性。将培养皿及营养琼脂在121℃高压蒸汽灭菌15 min，将融化的营养琼脂培养基倒入灭菌的培养皿中（培养基量为15 mL/1个培养皿）。自然冷却，凝固后备用。预先把大肠杆菌供试菌菌种用营养琼脂固体培养基进行菌种活化，然后挑取菌苔用灭菌生理盐水配制成含菌数约106个/mL～107个/mL的菌悬液，备用。待琼脂冷却凝固后，在超净台上，用无菌棉球蘸取菌悬液以划线法均匀涂在培养基上。静置10 min，用灭菌的孔径为7 mm的打孔器打孔，用灭菌镊子取出琼脂快留下圆形小孔。将藏茴香水溶性活性成分样液吸取一定体积，滴于圆形孔中，其中一个孔，不加样液，做空白对照。将培养皿放入恒温培养箱在37℃下培养12 h后，翻面继续培养12 h。取出后，测量抑菌圈直径的大小［10-11］。

1.3.4干物质测定方法及抑菌物质得率的测定

1.3.4.1干物质测定方法

将称量瓶洗净，置于50℃烘箱中烘2 h左右，烘干水分，取出冷却后用分析天平称重。复烘至恒重（2次称重相差不超过0.002 g即为恒重）。此重量即为称量瓶重量（W1），记录该称量瓶的号码和重量。加入一定体积1.3.2项收集的样品液至已恒重的称量瓶中，将样液摇匀，放入烘箱中烘干。将称量瓶及样液从烘箱中取出后，用分析天平称重。复放入烘箱中烘3 h～4 h，取出称重。重复操作至两次称重相差不超过0.002 g后，记录烘干恒重后总重量（W2）。

式中：W为样品干物质量，g；W2为称量瓶和试样至恒重总重量，g；W1为称量瓶重量，g。

1.3.4.2抑菌物质得率的计算方法

精密量取1.3.1项下制得的样液（干物质总含量1.66 g/mL）10 mL，样液中总干物质含量为M1。经1.3.2工艺树脂吸附，解析处理后得到乙醇收集液。将乙醇洗脱液放入烘箱烘干，得到分离纯化后抑菌成分干物质M2。抑菌物质得率的计算公式如下：

式中：η为抑菌物质得率；M1为样液中总干物质质量，g；M2为抑菌成分干物质质量，g。

1.3.5AB-8型大孔吸附树脂预处理

大孔吸附树脂用于分离纯化中药有效成分具有十分广阔的前景，与其它纯化方法相比显示出其优越性。同时，树脂可以连续使用3次以上而对试验结果影响不大［12-13］，连续使用后可再加入乙醇、酸、碱类介质进行再生处理后继续使用。初次使用，其预处理方法如下：

将AB-8大孔吸附树脂先用蒸馏水浸泡2 h，滤去蒸馏水。以一定量的浓度为95%的乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀。用蒸馏水冲洗至浸液中加适量蒸馏水无白色浑浊现象，再用蒸馏水反复冲洗干净至无醇味，滤纸吸干表面水分备用。

1.3.6单因素试验设计

考察不同吸附时间、样品上柱液浓度、洗脱剂浓度3个因素对大孔吸附树脂分离纯化效果的影响。

1.3.6.1吸附时间对AB-8型大孔吸附树脂吸附效果的影响

精密量取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂20mL共四份，分别置于100 mL三角瓶中。精密加入1.3.1项下制得的样液各10 mL，样液浓度为1.66 g/mL。放入恒温振荡器振荡吸附不同时间（2 h～12 h恒温振荡器温度为30℃）。将吸附好的树脂湿法上柱，上柱径高比（层析柱内径与树脂装入高度比）为1.5∶20。按1.3.2项的方法处理吸附好的树脂，即先加入100 mL蒸馏水洗去杂质，然后用浓度70%的乙醇100 mL为洗脱剂（洗脱杂质用蒸馏水及洗脱剂流速均控制在3 mL/min～4 mL/min）进行解析。收集洗脱液，将收集液放入烘箱（控制在40℃～50℃之间）将乙醇完全挥发干净。继续烘干，得到抑菌活性物质，所得干物质用1.00 mL蒸馏水溶解，平板培养基打孔法验证不同吸附时间对吸附抑菌试验验证抑菌效果。

1.3.6.2样品上柱液浓度AB-8型树脂对回收率的影响

精密量取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂20 mL共四份，分别置于100 mL三角瓶中。精密吸取1.3.1项下制取的样液各10 mL，分别加入不同体积的蒸馏水混匀。混匀稀释后，样液浓度范围为0.55 g/mL～1.66 g/mL。分别加入到三角瓶中与树脂混匀，放入恒温振荡器振荡吸附12 h（恒温振荡器温度为30℃），使其达到饱和吸附。以蒸馏水，70%浓度的乙醇各100 mL为洗脱剂进行解析。以1.3.2项的方法得到抑菌成分干物质，依次计算活性成分得率，并做抑菌试验测其抑菌圈直径。由此测定不同浓度样品上柱对分离纯化的影响效果。

1.3.6.3洗脱剂浓度对AB-8型树脂洗脱效果的影响

精密量取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂20 mL共四份，分别置于100 mL三角瓶中，精密加入1.3.1项制取的样液各10 mL，样液浓度为1.66 g/mL。放入恒温振荡器振荡吸附12 h（恒温振荡器温度为30℃），使其达到饱和吸附。将吸附好的树脂分别湿法上柱，对应先加入100 mL蒸馏水洗去杂质，然后分别以30%～90%不同浓度的乙醇各100 mL为洗脱剂进行解析。所得解析液按1.3.2方法处理。由所得抑菌成分得率和抑菌试验测得的抑菌圈直径来分析洗脱剂浓度对洗脱效果的影响。

1.3.7正交优化试验

综合单因素试验结果，选定吸附时间（A）、样品上柱液浓度（B）、洗脱剂浓度（C）3个对活性成分分离纯化效果影响较大的因素，进行3因素3水平的正交优化试验。试验因素与水平设计见表1。

表1　正交因素水平表Table 1Levels and factors of orthogonal design

2结果与讨论

2.1单因素试验结果及分析

2.1.1吸附时间对吸附效果的影响

吸附时间对吸附效果的影响见表2及图3。

由表2可知，其他条件一定时，随着树脂吸附时间的延长，最终得到的干物质含量增多。当吸附时间达到8 h以上，抑菌成分的得率较大。图2表明，随着吸附时间的延长，得到的活性成分抑菌圈直径呈增长趋势。表2及图2说明，在其他条件不变时，吸附时间的长短直接影响着藏茴香水溶性活性物质的得率大小及抑菌效果。如图3所示，吸附时间较长时，吸附的活性物质量较大，吸附效果较好，用乙醇解析后得到的抗菌物质含量较高，抑菌效果较好，抑菌圈直径较大（如图3所示）。

表2　吸附时间对吸附效果的影响Table 2Effect of adsorption time on adsorption

图2　吸附时间对抑菌成分抑菌效果的影响Fig.2Influence of adsorption time on antibacterial effect

图3　吸附2 h（左）和吸附12 h（右）得到的抑菌成分抑菌效果图Fig.3Pictures of antibacterial effect of active ingredient after adsorption 2 h（left）and 12 h（right）

2.1.2样液浓度对分离纯化效果的影响

样液浓度对活性成分分离纯化效果的影响见表3及图4和图5。

表3　上柱液浓度对吸附效果的影响Table 3Influence of concentration of solution on adsorption effect

图4　样液上柱浓度对分离纯化抑菌成分效果的影响Fig.4Effect of concentration of liqueur samples on purification

图5　样液加水0BV（左）和2BV（右）抑菌效果图Fig.5Pictures of antibacterial effect of active ingredients from different dilution such as 0BV and 2BV

由表3可见，在其他条件一定时，将样液加水稀释可以增大抗菌物质得率。当样液加水体积增加至2 BV，活性成分得率为最大。当稀释倍数继续增大，活性成分得率和抑菌效果又趋于下降。在一定范围内，样液浓度过大，分子间作用力增大，游离有效成分减少导致吸附量下降。而样液太稀时，流动性太大，相同时间内树脂难以充分吸附。由图4及图5可见，将样液稀释一定体积，抑菌圈直径逐渐增大，加水体积增大至两倍时，抑菌圈直径最大。继续稀释，抑菌圈直径又会变小。因此，适当的样液稀释利于活性抑菌物质的吸附，进而得到较大的抑菌圈直径。同时还可除去部分杂质，由此增强抑菌效果。

2.1.3洗脱剂浓度对分离纯化效果的影响

洗脱剂浓度对洗脱效果的影响见表4及图6和图7。

表4　洗脱剂浓度洗脱效果的影响Table 4Effect of ethanol concentration on the elution

图6　洗脱剂浓度对分离纯化效果的影响Fig.6Effect of ethanol concentration on purification

由表4可知，在其他条件一定时，随着洗脱剂乙醇浓度增大，抑菌成分的得率逐渐增大。由图6及图7可知，乙醇浓度增大的时，抑菌物质对大肠杆菌的抑菌圈直径逐渐增大。乙醇浓度增至70%～90%时洗脱率已经很高，但是乙醇浓度高却极易挥发，从经济，节约出发选用较低乙醇洗脱即可有明显的抑菌效果。

图7　30%乙醇（左）和90%乙醇（右）做解析液抑菌效果图Fig.7Pictures of antibacterial effect of active ingredients from different elution liquid such as 30%and 90%ethanol

2.2藏茴香水溶性活性成分分离纯化正交试验结果

2.2.1正交试验结果及分析

正交分析试验设计结果如表5。

表5　正交试验设计及结果Table 5Design and results of orthogonal

由表5可见，各因素对指标X抑菌圈大小影响的主次为B>C>A，即样品上柱液浓度>洗脱剂浓度>吸附时间。根据K值选择的较优参数组合为A2B3C3，即吸附时间为8 h，加入样液3 BV的水稀释样液，用90%乙醇做洗脱剂洗脱水溶性抑菌成分。对于指标Y抑菌成分得率的主次因素为B>A>C，即样品上柱液浓度>吸附时间>洗脱剂浓度。较优参数组合为同上，为A2B3C3。

2.2.2较优工艺条件的验证

结合正交试验得出提取的最佳工艺参数为：吸取1.3.1项下制备的样液10 mL加入样液3 BV的水稀释样液，与20mL经预处理的AB-8大孔在30℃水浴振荡器中吸附为8h。将吸附好的树脂湿法上柱，保持径高比为1.5∶20。先用100 mL蒸馏水以3 mL/min～4 mL/min的流速洗去杂质，再用90%乙醇100 mL做洗脱剂以3 mL/min～4mL/min的流速进行解析。将得到的收集液放入烘箱烘干，完全除去乙醇的干扰后，做抑菌试验。平行试验3次，藏茴香水溶性抑菌成分得率分别为1.83%、1.90%、1.88%，平均得率为1.87%。抑菌圈直径分别为19.54、19.70、19.62 mm，平均抑菌直径为19.62 mm。根据正交试验结果直接选择的试验因素水平最佳组合为A2B3C1，平均抑菌圈直径为20.4 mm，抑菌物质得率为2.21%，抑菌圈直径及抑菌物质得率均高于根据K值选择的组合A2B3C3。因此，最终选择的最佳工艺条件为A2B3C1，即吸附时间为8 h，加入样液3 BV的水稀释，洗脱液乙醇浓度为50%。

3结论

试验结果表明，吸附时间、上柱液浓度、乙醇浓度对藏茴香水溶性活性成分分离纯化效果的影响作用大小依次为上柱液浓度>乙醇浓度>吸附时间。通过正交分析法优化了藏茴香水溶性抗菌成分分离纯化工艺，纯化工艺条件为：吸附时间为8 h，加入样液3 BV的水稀释样液，用50%乙醇做洗脱剂洗脱水溶性抑菌成分得率及活性都较高，验证试验结果与正交试验结果接近，说明采用正交试验筛选藏茴香水溶性活性成分分离纯化工艺是可行的。

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Separation and Purification of Water Soluble Active Ingredient from Garaway

WANG Shu-lin，WANG Rui，WANG Xiu-yu
（Agriculture and Animal Husbandry College，Qinghai University，Xining 810016，Qinghai，China）

The technologies of purification of water-soluble antibacterial ingredients from caraway were studied using single factor and orthogonal test.The results showed that the adsorption time of 8 h，3 BV of water added to sample solution，with 50%ethanol as eluent to obtain antibacterial ingredient，which showed had good inhibitory effect on bacterial of E.coli.

caraway；water-soluble；anti-bacterial ingredients；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.008

2013-11-25

青海省科技厅中小型企业创新补助资金（2012-G-C05）项目

王树林（1970—），男（汉），教授，博士，研究方向：食品生物及食品加工技术。