中药材对黄曲霉毒素B1快速检测的影响

北京市药品检验所（100035）李辉

黄曲霉毒素（Aflations，简称AFs）是食品和药用植物中最为常见霉菌毒素黄曲霉（Aspergillus. favus）和寄生曲霉菌（Aspergillus. parasiticus）的次级代谢产物[1]。其污染范围广泛，存在于花生、玉米、小麦以及中药材等产品中。AFs的基本结构为二呋喃环和香豆素，黄曲霉毒素B1（AFB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素），前者为基本有毒性成分结构，后者属于引起致癌性作用的有效基团[2]。AFB1是一种剧毒和强致癌性物质，主要作用的靶器官是肝脏，能够引起慢性肝炎、肝坏死及肝硬化等肝脏疾病[3]。

目前，已有检测AFs含量的方法主要分为下列几种，一类是以色谱技术为基础的理化检测方法，即生物鉴定法和仪器检测法[4]。仪器检测法包括薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）等；另一类是应用免疫层析技术的化学检测方法，包括放射免疫法（RIA）、免疫亲和柱法（IAC）、酶联免疫吸附法（ELISA）以及试纸条法等。由于常规仪器分析技术不能满足毒素快速筛查目标，试纸条检测法应运而生。但是，中药材自身化学组分复杂，基质干扰大，常对试纸条检测结果造成假阳性的干扰。因此，本文以莲子、当归、山楂、麦芽及大黄为研究对象，初步探讨试纸条检测技术在中药中AFB1快速检测应用及影响因素，为建立中药中AFB1快速检测方法提供参考。

1 胶体金免疫层析技术在中药材真菌毒素检测中的应用

胶体金免疫层析技术是20世纪80年代继荧光素标记技术、放射性同位素标记技术及酶标记之后发展起来一种固相快速免疫诊断技术[5]。该技术利用金纳米颗粒作为示踪物，以抗原结合抗体表现出的直观颜色变化来判定样品中是否含有抗原，从而达到检测目的。

目前，胶体金免疫层析技术以其高特异性、高灵敏性、方便快速检测应用于食品、药品等快速检测中[6]。但是，应用此技术用于检测中药中的真菌毒素研究尚未报道。大多由于中药自身化学成分复杂、基质干扰较大并需要繁琐的前处理条件，以至于研究者很少关注中药材真菌毒素快速检测。随着中药的国际化，中药出口的问题化也越来越严重，中药“治病”和“产病”一直是大家关心的话题。大量研究表明中药材易被真菌毒素（如：黄曲霉毒素，赭曲霉毒素等）污染[7]。所以，建立一种快速便捷的中药材真菌毒素检测方法势在必行。胶体金免疫层析技术应用的范围越来越广泛，今后，利用胶体金免疫层析技术检测中药材中真菌毒素将是筛查真菌毒素污染的最好方法。

2 试纸条法对中药材选取影响

中药材中可能存在的外源性污染主要包括真菌毒素残留、农药残留、重金属及有害元素残留等[8]。中药中的有害残留物主要来自于药用植物在生长过程中接触的土壤、水、大气等自然环境和炮制、加工、运输、贮藏等过程中的污染。为了监测和控制真菌毒素的污染，同时保障人类的身体健康。简单、灵敏、准确、快速、经济的真菌毒素分析方法的建立是近年的研究重点和热点。

由于，中药材所含化学成分种类多，基质复杂，而真菌毒素的分析又属于痕量分析，大大增加了检测难度。而胶体金免疫层析技术是金颗粒作为标记物，以特异性的抗原和抗体结合反应而表现出的颜色变化，来判定检测结果的，待测物结构与最终制备的试纸条灵敏度关系甚大。中药材中不乏有些化学成分与AFB1的结构相似，常常会造成检测结果的假阳性。为避免假阳性事件的发生，选择合适的中药至关重要。

另一方面，我国药用植物资源丰富，临床常用的预防治疗疾病的植物多达700多种，不可能把所有中药都作为研究对象。因此，优选常见大宗药材作为前期研究对象可为今后建立其他中药中AFB1快速筛查提供依据。

2.1 中药药用功效研究 选取即可药用又可日常保健的中药作为研究对象，这类中药兼具保健、食补、强身、健体多重功效，现实生活使用频率较高。选取此类中药不仅可以提高中药品质，也能够保障人类身体用药安全[9][10][11][12]13]。同时，对补充和完善中药AFB1快速检测方法非常必要。本文以莲子、当归、山楂、麦芽及大黄为研究对象，其性效用见附表1。

附表1 5种中药药性效用分析

附表2 选取的5种中药化学成分分析

附表3 中药的基质效应考察

2.2 中药的化学成分研究 在选取中药时，化学结构对中药中黄曲霉毒素B1的快速筛查的影响大。由于AFB1结构含有香豆素类成分，所以，应用胶体金免疫层析试纸条会对含有香豆素类成分的中药检测的假阳性出现率高。5种中药所含的化学成分见附表2。可以看出，中药化学组分中不含有香豆素类成分，可能对试纸条检测结果假阳性率影响较小。

2.3 中药的基质效应考察 中药材基质效应是造成试纸条检测假阳性重要原因，同时，基质效应简单的药材对制备的试纸条前处理液有良好的适应性。考察选取的5种中药的基质效应影响。具体实验步骤如下。

①将药材粉碎，过40目筛，精密称取供试品粉末2g，加入10mL甲醇-水（80:20，v/v），浸泡20min，涡旋振荡10min，5000rpm离心5min；②精密吸取500μL上清液经N2吹干，配制成低、中、高三个浓度水平的加标溶液，其中AFB1的加标水平为1，5，25ng/mL，将制得样品液；③采用UPLC-MS/MS进行分析检测，每个浓度2份，每份样品重复测定3次；再用色谱甲醇配制相同浓度的标准品溶液，每个浓度2份，进样分析，按照以下公式基质效应（ME%）=（加标样品峰面积/标品峰面积）×100%[14]计算两组峰面积的比值，分别考察5种药材的基质效应，结果见附表3。中药材的基质效应影响小，药材中AFB1经一步提取法检测时受基质效应的影响越小。简单的样品检测液也能保证在制备的试纸条上顺利地完成检测过程。

3 讨论

AFB1是由黄曲霉菌和寄生曲霉产生的刺激代谢产物，为有害致癌性物质。其化学性质稳定，不易被分解，毒性强，可通过食物链在生物体内转移并蓄积。不断堆积的AFB1不仅给农作物生产带来巨大损失，而且严重危害人类的身体健康。随着，中药材国际化进程的加快，中药的质量安全和品质保证成为关注的热点话题。为保障人类健康不受危害，需要通过一种快速检测的手段对真菌毒素进行初步筛查。胶体金免疫层析技术以其快速、灵敏、便捷、稳定、操作简便等特点受到广泛的重视。

由于免疫层析技术并没有在中药检测方面得到广泛地应用。因此，在中药材作为检测研究对象时，一般需要遵循以下原则：①选取常见大宗中药中易污染黄曲霉毒素的中药作为研究对象。②剔除化学成分上与AFB1结构相似的中药，如理化结构中含有香豆素类成分不作为本次实验的研究品种。③选取即可药用又可日常保健的中药作为研究对象，这类中药多具保健、食补、强身、健体多重功效，现实生活使用频率较高。选取这类药物不仅可以提高中药品质，而且，能够保障人类身体用药安全。