免疫标记法在汗潜手印的显现与成分检测中的应用进展

汤凤梅，马荣梁，冯永杰，吴 浩，曲会英，刘 寰

（1.公安部物证鉴定中心，北京100038；2.辽宁警察学院，辽宁 大连116036；3.江苏省公安厅 刑警总队，江苏 南京 210000）

手印是指人手指、掌表面的乳突纹、屈肌褶纹、皱纹等皮肤花纹结构在力的作用下接触客体时所形成的能反映花纹结构与外形结构特点的印痕总称，包括指头印、指节印、手掌印等。手印，作为刑侦领域最重要的物证之一，在人身认定中发挥重要的作用。形成汗潜手印的物质主要是指掌皮肤汗腺分泌的汗液，包括水、多种无机物和有机物，如氯化钠、尿素和各种氨基酸。汗潜手印物质中实际上还包括脂类物质，如脂肪酸、甘油、固醇等。虽然指掌面没有皮脂腺，但是人们在日常生活习惯中会经常接触皮脂较多的部位（例如头面部），于是指掌表面的脂类物质留存在手印纹线中[1]。

针对手印物质中的各种成分，已经建立了粉末显现法、茚三酮显现法、DFO显现法以及502胶熏显法等传统方法。在实际工作中，现场潜在手印的显现主要存在两个难题：一是某些疑难复杂客体表面上的手印，采用现有方法的显现效果难以令人满意；二是手印显现的灵敏度仍然有待提高，以显现痕量汗液物质形成的手印或陈旧手印等。各国学者正努力从两个方面来解决上述难题：一是研发新材料、建立新技术，来提高显现方法的灵敏度，同时拓展方法适用客体范围；二是充分发掘汗潜手印提供的潜在信息，不仅仅局限于手印的形态，更深入研究手印物质中的特殊成分，通过对特殊成分的测定确定嫌疑人的生活习惯，即通过手印物质对嫌疑人进行描绘。因此，免疫标记法应运而生，与传统方法相比，该方法不仅能够显现汗潜手印，同时，基于抗原抗体特异性反应，还能完成手印物质中某些特定成分的测定，以此作为依据，推断嫌疑人接触过或食用过何种毒品，或者具有哪些生活习惯，例如吸烟，或者患有某种疾病等。

1 免疫标记技术（Immunolabelling technique）

该技术是以放射性同位素、荧光素、酶、生物素、胶体金、化学发光元素、铁蛋白等作为示踪物标记抗体（或抗原），通过抗原抗体特异性反应，并借助精密仪器对示踪物进行测定，借此鉴定未知抗原（或抗体）[2]。近年来，针对汗潜手印的显现与成分检测所采用的示踪物主要以荧光素为主，即采用免疫荧光技术，该技术主要分为直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。

直接免疫荧光法是将荧光素标记的抗体直接与相应抗原反应。该方法虽然具有简单、快速、特异性好的优点，但是，针对每种抗原需制备相应的荧光抗体，因此，该方法在汗潜手印显现中的应用鲜有报道。

为了克服直接免疫荧光法的不足，发展了间接免疫荧光法，该方法则是将荧光素标记到与一抗特异性结合的二抗上，制备一种荧光标记的二抗。这种二抗可以用于检测同种动物的多种抗原抗体系统，因此，在汗潜手印的显现中应用较多。间接免疫荧光法主要分为三个步骤：第一步，用未标记的一抗进行孵育，部分抗体与存在的抗原进行特异性结合，洗涤去掉未结合的抗体；第二步，加入荧光标记的二抗再次孵育，此时标记的二抗与一抗相结合，然后，洗涤去掉未结合的二抗；最后，对结合在抗体上的标记物进行定性。若手印物质中有抗原存在时，标记物通常导致荧光手印的生成。当无抗原存在时，则不会发生抗原与一抗的结合，也不会发生一抗和二抗试剂的结合，因此没有荧光信号产生。

2 间接免疫标记法在汗潜手印的显现与成分检测中的应用

最早将免疫技术应用于汗潜手印的研究起源于1977年，Ishiyam[3]与其研究团队，针对分泌型人群（即能分泌血型抗原的人群），利用抗体（凝集素），通过抗原抗体反应产生凝集现象，即混合细胞凝集反应（mixed cell agglutination reaction，MCAR），对透明胶带粘面上的手印物质进行血型分析，研究的意外结果是显现出汗潜手印。Tshiyam等还进一步考察纸张客体，采用茚三酮显现后，继续采用MCAR技术比单独使用茚三酮的显现要灵敏很多，效果有显著提高。近年来，国内外学者对免疫标记技术在汗潜手印的显现与成分检测的研究主要围绕以下几种组分[3]：氨基酸、蛋白质和多肽（角蛋白、组织蛋白酶、皮离蛋白、人血清白蛋白等）、尼古丁代谢产物（可替宁）、毒品（四氢大麻酚，美沙酮）及其代谢产物（美沙酮代谢产物EDDP，吗啡，苯甲酰芽子碱）等。

2.1 氨基酸

手印物质中，氨基酸类物质浓度可达0.3～2.5 mg/L。Spindler等[4]利用抗L-氨基酸抗体（anti-L-amino acid antibodies），来显现铝箔、玻璃、瓷砖上的汗潜手印，原理如图1所示。首先，分别通过直接吸附法和间接共价法两种方法将抗体（一抗）修饰到16 nm的金纳米颗粒（gold nanoparticles，AuNPs）上，制备出抗体修饰的AuNPs溶液。然后，将该溶液滴加到汗潜手印表面，手印物质中的氨基酸与AuNPs上的抗体发生特异性结合。最后，加入荧光红610标记的二抗，二抗与一抗相结合。在590nm波长的光源激发下，通过650nm的滤色片，观察得到荧光手印。研究表明该方法适合几个月以上或者未知手印的显现，对3个月以内的新鲜手印显现效果不好，主要是由于两个原因：其一，手印物质被免疫试剂溶解并引起扩散；其二，采用的冲洗溶剂对抗体溶解度低，引起的背景染色。后来，作者采用磷酸盐缓冲溶液作为冲洗溶剂，能有效降低背景染色。

图1 采用两种方法制备的功能化金纳米粒子显现汗潜手印[4]（根据参考文献[4]，已获得转载许可，版权归 Royal Society of Chemistry所有。）

2.2 蛋白质和多肽

与氨基酸相比，对蛋白质和多肽的研究更为广泛，主要有以下几种：角蛋白（Keratin）来自于细胞脱落过程；组织蛋白酶Cathepsin-D来自于细胞脱落过程和汗液；皮离蛋白（Dermcidin）来自汗液；人血清白蛋白（Human serum albumin）一种载体蛋白[5]；表皮细胞生长因子（Epidermal growth factor，EGF）是一种低分子量的多肽，由53个氨基酸分子组成，在细胞生长、增殖、分化和修复中发挥重要作用；溶菌酶（Lysozyme）是人体汗腺分泌的一种抗菌酶，是免疫系统固有防御体系的一部分，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid，NAM）的 1位碳原子和 N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl-d-glucosamine，NAG）的 4 位碳原子间的β1-4糖苷键，来破坏革兰氏阳性细菌的细胞壁[6]。

2009年，Drapel等[5]分别针对手印物质中的角蛋白、组织蛋白酶和皮离蛋白，采用Invitrogen生产的商品化试剂盒Chrome Breeze immunodetection kits，按照试剂盒操作手册，将聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜和纸张上的手印显现出来。在此研究基础上，van Dam等[7]与其研究团队进行了更深入的研究。首先，在渗透性的硝酸纤维素膜（NCM）上捺印汗潜手印，分别只针对手印物质中的皮离蛋白/人血清白蛋白，采用相应的鼠的单克隆IgM抗皮离蛋白抗体/IgG2a抗人血清白蛋白抗体进行结合，在采用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的羊抗鼠的IgM/IgG二抗与之结合，在特定波长的光源激发下，显现出荧光手印。然后，van Dam等[7]分别采用荧光探针Lightning-Link Rapid DyLight 350和Cy3与两种抗体相结合，同时对NCM膜/玻璃片上的手印物质中的两种蛋白进行标记，在不同的波长的光源激发下，显现出荧光手印。

由于显现出的荧光手印只能显现出两种蛋白的分布点，间接反映出汗孔的分布，而反映出来的细节特征很少，所以，van Dam等[8]进一步设想了该免疫标记法是否可以与传统显现方法相结合，先采用传统方法对汗潜指纹进行显现，玻璃片上采用磁性粉显现，NCM膜上采用茚三酮显现，然后针对皮离蛋白，采用荧光免疫标记的方法进行显现，NCM膜上的显现效果（见图2）。研究结果表明该免疫标记法与这两种传统显现方法具有很好的兼容性，效果上可以互补。针对NCM膜和玻璃片这两种客体，van Dam等[9]进一步考查了免疫标记法与其他传统手印显现方法的匹配性。先采用传统显现方法，然后针对手印中的皮离蛋白，采用免疫标记法进行显现。其中，渗透性的NCM膜上的手印，采用茚满二酮-锌盐（IND-ZnCl），茚满二酮-锌盐-茚三酮（IND-NIN），物理显影液（physical developer，PD）进行显现；非渗透性的玻璃片上的手印，采用502胶熏显，502胶熏显-基础黄染色（CABY），荧光502胶熏显（Lumi-CA）和聚腈基丙烯酸酯熏显（Poly-CA）进行显现。研究结果表明只有Lumi-CA和Poly-CA显现方法不推荐与免疫标记相结合，显现效果不好。van Dam等[10]还进一步考察了免疫标记法适用的客体范围，研究了非渗透客体（铝箔、不锈钢钥匙、塑料瓶、垃圾袋、包装袋、自封袋），半渗透性客体（瓷砖和薄纸板），渗透性客体（复印纸和热敏纸），结果表明：薄纸板和复印纸不适合免疫标记法显现，其他客体均能够显现出具有鉴定价值的手印；载体表面的多孔性和疏水性可以影响免疫标记方法的应用，载体表面孔的尺寸影响手印物质的吸附，因此影响抗原的测定；示踪物的选择要进行试验，有些结果违反常规，当客体具有荧光性，例如热敏纸和复印纸，可以采用辣根过氧化物酶（HRP）代替FITC和Cy3作为示踪物。

图2 NCM膜上采用茚三酮显现与免疫标记显现相兼容[8]（根据参考文献[8]，已获得转载许可，版权归 Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA所有）

目前，国内采用免疫标记法显现指纹的相关研究比较少，2014年，He等[6]建立了免疫多金属沉积（Immunological Multimetal Deposition，iMMD）显现胶带上的汗潜手印的方法，采用抗体修饰的金纳米粒子（antibody-AuNPs）与手印物质中的抗原反应，然后通过银染（Silver staining）的方法进行显现出黑色纹线的手印。其中AuNPs不仅作为抗体的载体，用来进行识别生物分子，同时，也作为自动金相沉积的成核点，即单质银在AuNPs表面进行沉积。He等采用人免疫球蛋白（Human immunoglobulin G，hIgG）对胶带上的汗潜手印进行浸染，来优化iMMD的反应条件。研究发现：抗原和抗体的结合时间增长，显现效果变好，但是结合时间过长，背景颜色也变深，可能是由于AuNPs与底物的非特异性结合，并且银染时引起银的沉积；免疫反应时的温度对iMMD的效果影响不大；显现效果随antibody-AuNPs的浓度的增加而增强；银染时间长，显现效果好，但过长背景也变黑了。最后针对手印物质中的表皮细胞生长因子（Epidermal growth factor，EGF）和溶菌酶（Lysozyme），He 等[6]分别采用对应抗体修饰的金纳米粒子进行iMMD反应，显现出手印（见图3）。该方法具有灵敏度高（手印物质中ng级的成分），快速和特异性强等优点。

图3 免疫多金属沉积法显现胶带上的汗潜手印[6]（根据参考文献[6]，已获得转载许可，版权归 Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA所有）

2.3 尼古丁代谢产物——可替宁制

针对吸烟者汗液里的一种尼古丁代谢产物可替宁（cotinine），Russell[11-14]与其研究团队进行了深入的研究。Leggett等[11]制备出抗可替宁抗体修饰的纳米金颗粒（anti-cotinine AuNPs）：采用双功能交联剂3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）将protein A交联在纳米金颗粒上，然后在protein A上交联抗可替宁抗体。anti-cotinine AuNPs与手印物质中的可替宁发生抗原抗体的特异性免疫反应，然后加入荧光标记的二抗进行反应，显现出玻璃片上的汗潜手印。将抗可替宁抗体修饰到AuNPs表面，在其表面覆盖大约50～60个抗体，提高了抗体抗原结合物的活性，并为荧光标记的二抗提供更多位点，所以荧光信号增强，可以观察到二级特征（细节特征）和三级特征（汗孔）。如果不结合纳米金颗粒，只能证明吸烟经历，但是显现出手印不具备同一认定的条件。在阴性对照试验中，采用anti-cotinine AuNPs显现不吸烟者的汗液手印，结果显现不出手印，证明抗原与抗体的特异性结合。在此研究基础上，Hazarika等[12]建立了15 min快速检测可替宁的方法：采用商品化的蛋白A/G包覆的磁性颗粒代替纳米金颗粒，修饰上抗可替宁抗体，结合荧光标记的二抗，显现玻璃片上的汗潜手印。Hazarika等考察抗体抗原反应时间对显现效果的影响发现，孵育反应10min时，手印纹线由白色变为黄色，所以加上冲洗步骤，可以在15min显现出玻璃片的汗潜手印，并确定可替宁的存在（见图4）。

图4 以可替宁为抗原采用免疫标记法显现玻璃片上吸烟者的汗潜手印[12]（根据参考文献[12]，已获得转载许可，版权归 Royal Society of Chemistry所有）

Boddis等[13]将该方法应用于白色瓷盘客体，吸烟者汗液中有可替宁存在，能够显现出荧光手印；不吸烟者汗液中没有可替宁，原则上显现不出手印，但是实际上显现出“负”的结果，即显现出荧光手印，但是阴阳纹线颠倒。除了考察免疫标记法适用的客体范围，Boddis等[14]还考察了保存条件对显现效果的影响。针对吸烟者玻璃片上的汗潜手印，Boddis等考察了4周内，4种不同条件下的显现效果：室温光照，室温黑暗，55℃黑暗，-20℃黑暗。55℃黑暗条件下保存的手印显现效果最好，可能是去除了挥发性物质，同时抑制了细菌对脂类、蛋白质的降解以及鲨烯（squalene）的氧化。而-20℃黑暗，手印显现质量下降，超过2周显现质量不好。室温光照的情况下，手印物质脱水，粘滞性增加，细菌和UV使其中的脂类和蛋白质物质发生氧化，从而引起手印物质的降解。在UV下，手印物质中的鲨烯发生过氧化反应，生成环氧化物和过氧化氢物，进一步降解生成丙二醛，甲醛，乙醛，丙酮，这些物质化学性质活泼，具有挥发性，进而引起手印物质的降解。研究表明手印物质降解由光和细菌共同作用，黑暗条件下，手印物质发生氧化和降解的速度比较慢。

2.4 毒品及其代谢产物

免疫标记法在显现含有可替宁的手印中发挥了很大的作用，因此，Russell[15-16]与其研究团队将该方法应用于手印中毒品及其代谢产物的检测。Pompi等[15]分别针对吸毒者汗潜手印中的四氢大麻酚（THC，大麻的主要成分），美沙酮和其代谢产物（EDDP，2-亚乙基-1，5-二甲基-3，3-二苯基吡咯烷），苯甲酰芽子碱（可卡因的代谢产物），采用商品化的蛋白A/G包覆的磁性颗粒，修饰上对应的抗体，与手印物质中的抗原发生反应，然后结合荧光标记的二抗，显现出手印（见图5）。后来，同时针对吸毒者汗潜手印中的吗啡（海洛因的代谢产物）和苯甲酰芽子碱（可卡因的代谢产物），Hazarika等[16]采用商品化的蛋白A/G包覆的磁性颗粒，分别修饰上对应抗体，将手印划分为两个区域，每个区域采用对应的抗体和二抗进行反应，显现出手印。该方法能够同时证明手印物质中存在两种代谢产物。Russell与其团队的研究成果在行业领域中受到高度评价[17-18]，该方法有很广泛的应用前景，不仅可以应用于可替宁和毒品的检验，还有望应用于爆炸物，以及可以作为诊断指示物的其他代谢产物和激素等。该方法还可能针对手印物质中RNA和DNA，与 STR（short tandem repeat）技术相结合。

图5 以四氢大麻酚为抗原采用免疫标记法显现玻璃片上的汗潜手印[15]（根据参考文献[15]，已获得转载许可，版权归 Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA所有）

3 免疫标记法的影响因素

在采用免疫标记法显现汗潜手印时，有时会出现非特异性结合，特别是采用载体颗粒时，可能非功能化的颗粒（即没有抗体修饰的颗粒）也会显现出手印，出现假阳性结果，对侦查起到误导作用[7]。以金纳米粒子为例，虽然被广泛用于手印显现中，但是被手印物质吸附的机理还不明确，目前存在两种不同的观点。普遍认为是酸性条件下（pH 3左右），手印物质中含有氨基基团的成分（例如氨基酸、蛋白质等）质子化，带正电；金纳米粒子由于吸附柠檬酸根离子带负电，从而被吸附到手印物质上。2014年，Moret[19]和其研究团队深入的研究纳米粒子显现汗潜手印的机理，提出了截然不同的观点。与金纳米颗粒相比，二氧化硅纳米颗粒表面更容易被修饰 （例如在其内部可以引入染料），能够研究更多的影响因素，所以Moret等采用二氧化硅纳米粒子进行机理研究。通过考察PH、Zeta电位、修饰基团（-COOH，-（COOH）2，-SO3H，-OP（O）（ONa）CH3）、离子强度等条件，证明二氧化硅纳米粒子被手印物质吸附是由于化学反应：纳米粒子表面的羟基与手印物质的氨基发生反应，生成酰胺键，并且此反应容易被二酰亚胺类物质（如EDC/NHS（N-ethyl-N′-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide）催化。以往的研究报道已经证明，载体颗粒在显现手印时起到信号放大的作用[11]，但是对非功能化载体颗粒的反应机理缺乏研究，所以，在建立免疫标记方法时，实验设计需要考虑多方面因素。

3.1 如何验证抗原与抗体为特异性结合

通常采用对照实验（Control experiment）来验证抗原抗体的特异性结合，主要包括阳性对照（Positive control）、阴性对照（Negative control）、同型对照（Isotype control）三种实验[7]。其中，阳性对照一般直接采用抗原的标准溶液利用免疫标记的方法进行显现标记，证明能够有荧光物质生成。阴性对照，则采用确定不含已知抗原的手印样本进行免疫标记。以可替宁为例，它只存在于吸烟者的手印物质中，那么阴性对照实验则采用不吸烟者的汗潜手印，进行免疫标记，来验证：没有抗原存在时，是显现不出荧光手印的。有时也做空白对照，即对含有抗原的手印样本，不加一抗或者同时不加一抗和二抗，来验证二抗是否会与手印物质或者与背景发生非特异性结合，以及手印物质是否会自发荧光。空白对照也属于阴性对照实验。同型对照则使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，代替一抗。例如标记手印物质中的皮离蛋白，如果一抗采用鼠的单克隆的IgM抗皮离蛋白抗体，二抗采用羊抗鼠的IgM FITC，则同型对照可以采用鼠的单克隆的IgM代替一抗，也可以采用鼠的单克隆的IgM FITC同时代替一抗和二抗。

3.2 尽可能减少客体表面的背景染色

本文已经提到引起背景染色的原因主要有两个[4]：一是免疫试剂引起手印物质扩散，二是冲洗时，未和抗原结合的功能化的颗粒没有被冲洗掉，而停留在客体表面上，这主要是因为所采用的溶剂对功能化颗粒的溶解度低所引起的。所以，冲洗时需要对洗脱方式和洗脱溶剂进行优化。

3.3 尽可能地降低非特异性反应的效果

对手印物质中的蛋白作为抗原进行标记时，通常先进行封阻（blocking），然后在进行抗原抗体反应，常采用牛血清白蛋白或脱脂奶粉将可能引起吸附的位点进行封闭，尽可能地降低非特异性反应的效果。

4 展望

针对汗潜手印物质中的特定成分，采用功能化的颗粒材料（如金纳米和磁性颗粒），通过免疫标记的方法，显现出汗潜手印，同时，确定特定成分的存在。与传统方法相比，免疫标记法的亮点在于能深入研究手印物质中的某种或某些特殊成分。以此作为依据，刑侦人员可以推断嫌疑人接触过或食用过何种毒品，或者具有哪些生活习惯，为侦破案件提供方向，缩小侦查范围。免疫标记法与某些传统方法可以相兼容，所以，可以先采用传统方法进行显现汗潜手印，然后通过免疫标记法确定手印物质中是否有某些特定成分，两种方法共同为同一认定提供依据。该方法还可以对免疫分析法测定手印物质中的某种特定成分的含量提供技术支持[20]。免疫标记法也存在着不足之处，例如，使用的抗体成本相对较高，操作步骤也比相对传统方法复杂。

国外相关学者和科研团队对免疫标记法已经进行了相关的研究，但是已报到的文献中，对不同的免疫标记方法适用客体的范围、出现假阳性结果、与传统方法的兼容性、保存时间和条件的影响等问题依然有待研究。国内关于免疫标记法在汗潜手印的显现与成分检测的研究比较少[21]，更缺乏系统深入的研究。目前，国内关于功能化的金纳米材料的合成、表征和应用的研究比较多[22-23]，免疫标记法用于显现汗潜手印以及对其中特定成分的检测也逐渐引起相关学者的关注[18，24]。免疫标记法能够在显现手印的同时，为刻画嫌疑人提供依据，为侦查提供方向，并且具有高灵敏度和高选择性的优点，将会在指纹显现领域发挥更广泛的应用。

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