停乳链球菌对日本沼虾总超氧化物歧化酶活性的影响

赵卫红张凤英於叶兵王资生齐志涛

（1.盐城工学院海洋与生物工程学院，盐城 224051；2.江苏省沿海池塘养殖重点实验室，盐城 224051；3.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090）

停乳链球菌对日本沼虾总超氧化物歧化酶活性的影响

赵卫红1，2张凤英3於叶兵1，2王资生1齐志涛1

（1.盐城工学院海洋与生物工程学院，盐城 224051；2.江苏省沿海池塘养殖重点实验室，盐城 224051；3.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090）

对健康的日本沼虾（1.40 ± 0.12）g分别肌肉注射0.6 × 106、2 × 106、4 × 106、6 × 106CFU/mL的停乳链球菌菌液10 μL，注射后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、5 d、10 d分别采集肝胰腺、肌肉和鳃组织，测定其中的总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性，研究停乳链球菌对日本沼虾T-SOD活性的影响。研究结果显示，肝胰腺中T-SOD活性于注射5 d后达到最大值（P ＜ 0.05），10 d后0.6 × 106、2 × 106和4 × 106CFU/mL组T-SOD活性下降并接近对照组水平，而最高浓度组（6 × 106CFU/mL）T-SOD酶活性仅有对照组的46%。肌肉和鳃中T-SOD活性均在注射6 h后达到最大值，注射10 d后，4 × 106和6 × 106CFU/mL组的肌肉和6 × 106CFU/mL组的鳃组织中T-SOD活性均仅有对照组的50%左右。另外，肌肉组织中T-SOD的峰值远高于鳃和肝胰腺组织中的峰值。上述结果表明，停乳链球菌不仅影响日本沼虾机体T-SOD酶的活性，而且肌肉、鳃和肝胰腺组织中酶的活性应答时间不同，且组织内酶活性的应答与菌的感染方式有关，另外，注射高浓度停乳链球菌长时间后会降低其组织中T-SOD酶活性。

停乳链球菌；日本沼虾；总超氧化物歧化酶

日本沼虾（Macrobrachium nipponense）是我国重要的淡水养殖经济品种，具有较高的食用价值和经济价值，并具有潜在的药用价值［1］，一直以来为人们所喜爱。近年来，随着人工化养殖技术的快速发展，规模化高密度养殖模式的普及，水产动物间病原体交叉感染严重，细菌病等疾病的暴发制约着日本沼虾产业的发展。在我国一些水产养殖地区，均不同程度地暴发链球菌病，给水产养殖业造成了严重的经济损失。大连某养殖场发生过对虾链球菌病，造成了严重的经济损失［2］。近年来，广东地区也出现南美白对虾感染链球菌病例。虽然未见日本沼虾养殖中链球菌病大规模爆发的报道，但是在本课题组的前期研究中发现，链球菌同样对日本沼虾具有感染致死作用。因此，研究链球菌对日本沼虾免疫机能的影响对防范该菌在虾类养殖中的大规模爆发，进一步探讨甲壳动物的免疫机制有着十分现实的意义。

超氧化物歧化酶（SOD）是细胞内最有效的抗氧化酶之一，是生物体内清除活性氧从而保护机体组织的第一道防线［3］。超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体内［4］，它以多种形式存在，主要有锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）和铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）［5］，这些SOD统称为总SOD（T-SOD）。SOD在抵抗各种应激因子上具有重要作用，如细菌［6］、病毒［7］、有毒化学物质［8］和热刺激［9］等。SOD可作为水产动物免疫机能的一个生物标记，其活性大小是衡量生物体免疫活性强弱的一个非常重要的参考指标［10］。本研究主要通过研究日本沼虾感染停乳链球菌情况下其肝胰腺、肌肉和鳃中T-SOD活性的变化，为甲壳动物抵抗病菌感染能力以及免疫调节机能的生理和分子机制提供相关的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验虾 2013年3月，于盐城通渝河购买日本沼虾，以新鲜的碎河蚌肉为饵料（投饵率4%-5%），上午7∶00、下午6∶00的投饵量分别占日投饵量的40%和60%，实验室暂养1周后挑选活力好、规格整齐（1.40 ± 0.12）g的健康个体作为实验虾。试验期间，24 h供氧，水温稳定在19℃左右，水质良好。

1.1.2 停乳链球菌的获得 停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae equisimilis）由中国科学院水生生物研究所淡水生态和生物技术国家重点实验室的李爱华研究员提供，来源于得病的鲟鱼（Sturgeon sp.），从10条患病的鲟鱼体内分离获得，通过生理、生化特性和分子鉴定确认。

1.2 方法

1.2.1 不同浓度停乳链球菌活菌的注射 本试验分为四组，每组分别注射0.6 × 106、2 × 106、4 × 106、6 × 106CFU停乳链球菌活菌10 μL，对照组注射同等剂量的PBS（0.1 mol/L，pH 7.0），每组3个平行，每个平行60尾虾。在第2腹甲和第3腹甲之间与身体呈45°角肌肉处进行注射，注射剂量10 μL。

1.2.2 日本沼虾组织的提取与处理 取样前24 h停食，为了检测链球菌注射后短时间（24 h内）和较长时间内虾体T-SOD活性的影响，于注射后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、5 d和10 d取5尾试验虾的肝胰腺、肌肉和鳃。-20℃保存待测。测定时肌肉和鳃按重量体积比加生理盐水制成10%的组织匀浆，肝胰腺制成5%的组织匀浆，6 000 r/min离心15 min，上清用于测定其T-SOD活性。

1.2.3 蛋白浓度测定 采用南京建成生物工程研究所考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒。蛋白计算公式如下：

蛋白浓度（g/L）=（测定管OD值-空白管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准管浓度（0.563 g/L）

1.2.4 T-SOD活性测定 T-SOD活性采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定，方法为黄嘌呤氧化法。T-SOD活性定义为每毫克组织蛋白在1 mL反应液中T-SOD抑制率达50%时所对应的T-SOD量为一个T-SOD活性单位（U）。依据上面所测的蛋白浓度，T-SOD活性计算公式如下：

T-SOD活性（U/mgprot）=（对照管吸光度-测定管吸光度）/对照管吸光度/50% × 反应液总体积/取样量（mL）/待测样本蛋白浓度（mgprot/mL）。

1.2.5 数据处理 考虑到注射应激和试验时间等因素对酶活性的影响，每组酶活性测定均采用试验组酶活性和对照组酶活性的比值，即试验组酶活性和PBS对照组酶活性的比值，用平均值±标准差（± s）形式表示。对上述比值采用 SPSS17.0统计软件和单因素（One-way）分析法进行处理。用Duncan氏多重比较法分析组间差异显著程度，显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 停乳链球菌对日本沼虾肝胰腺中T-SOD活性影响

结果显示（表1），注射5 d后肝胰腺组织中T-SOD酶活性在每个浓度组均达到最大值，均显著高于对照组（P ＜ 0.05），且随着注射浓度的增大，T-SOD活性逐渐增强，至6 × 106CFU/ mL浓度组肝胰腺中T-SOD活性达到最大值8.99 ± 0.00，与0.6 × 106CFU/mL、2 × 106CFU/mL和4 × 106CFU/mL浓度组差异显著（P ＜ 0.05）。注射10 d后肝胰腺中T-SOD活性相对于5 d显著降低（P ＜ 0.05），均低于对照组，且最高浓度组酶活仅有对照组的0.46倍。

表1 停乳链球菌对日本沼虾肝胰腺中T-SOD活性的影响

2.2 停乳链球菌对日本沼虾肌肉中T-SOD活性的影响

从表2可以看出，停乳链球菌注射6 h后，肌肉中T-SOD活性均升至峰值，且2×106CFU/mL组活性最强，显著高于其他各组（P ＜ 0.05）。4×106和6×106CFU/mL组酶活性在12 h和5 d均显著高于0.6×106和2×106CFU/mL组（P ＜ 0.05）。与感染5 d后相比，感染10 d后肌肉T-SOD酶活性，0.6×106CFU/mL组显著升高（P ＜ 0.05），其他3组，显著下降（P ＜ 0.05），且4×106和6×106CFU/mL组酶活性均仅有对照组的一半左右。

表2 停乳链球菌对日本沼虾肌肉中T-SOD活性的影响

2.3 停乳链球菌对日本沼虾鳃中T-SOD活性影响

感染不同浓度停乳链球菌6 h后鳃中T-SOD活性显著升高，且均达到峰值（P ＜ 0.05）（表3）。而感染3 h、24 h和5 d后，所有感染浓度组之间差异均不显著（P ＞ 0.05）。感染9 h后，0.6×106CFU/mL显著低于其它3组（P ＜ 0.05），感染12 h后，0.6×106和2×106CFU/mL组显著低于其它两组（P ＜ 0.05）。感染10 d后，最高浓度组（6×106CFU/mL）鳃中T-SOD活性降至最低值0.54 ± 0.01，约为对照组鳃中T-SOD活性的1/2，且显著低于其他浓度组（P ＜ 0.05）。

3 讨论

SOD是体内清除氧自由基最主要的酶，其活性的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力［11］。SOD活性高低与虾蟹的免疫机能状况密切相关［12］。本试验结果表明，注射停乳链球菌对日本沼虾肌肉、鳃和肝胰腺中T-SOD活性的影响不仅和菌液的浓度大小有关，还与感染时间长短有关。如多氯联苯（PCBs）刺激剑尾鱼（Xiphophorus helleri）12 h内，T-SOD活性略有上升，而在48 h和72 h内，T-SOD活性显著下降［13］；罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）受莫格球拟酵母（Torulopsis）感染致病后，T-SOD活性下降［14］；而红螯螯虾感染嗜水气单胞菌48-72 h SOD活性明显升高［15］。T-SOD产生如此复杂的变化，与动物体内相互关联的免疫系统有关。作为甲壳动物的日本沼虾，其免疫系统主要由血淋巴细胞和溶酶体酶组成，前者包括透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞，后者包括SOD、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等，血淋巴细胞的数量和种类会影响溶酶体的酶活，而且几种溶酶体之间亦有关联。

表3 停乳链球菌对日本沼虾鳃中T-SOD活性的影响

感染停乳链球菌5 d后日本沼虾肝胰腺中T-SOD活性随着感染菌液浓度的升高而增强。产生这一结果的原因可能是，随着感染菌液浓度的增加，虾体产生的氧自由基随之增加，作为甲壳动物最主要的免疫器官的肝胰腺，是清除体内氧自由基的主要器官，其T-SOD活性亦即随之增强。另外，停乳链球菌感染10 d后，在所有低浓度组（0.6×106和2×106CFU/mL）肌肉和鳃中T-SOD活性恢复到对照组水平，原因可能是低浓度感染10 d后，体内活性氧自由基被清除，机体对停乳链球菌感染入侵产生了应答；而高浓度组（6×106CFU/mL）感染10 d后所有组织中T-SOD酶活均显著降低，仅有对照组的50%左右。在盐度对SOD活性影响的研究中同样也发现，高盐度对SOD活性具有抑制作用［16］。以上结果同时也表明一方面可能是因为日本沼虾抗氧化调节机制是有限度的，高浓度停乳链球菌长时间感染对机体造成损伤，引起体内合成代谢受阻，T-SOD活性下降［17］；另一方面，可能是日本沼虾体内的部分血细胞的结构与功能遭到破坏和血细胞的寿命缩短等原因，致使血细胞新生数量减少［18］，而SOD酶主要来自于血细胞，从而造成T-SOD活性下降。这与王玥等［19］研究报道的氨态氮和亚硝态氮对罗氏沼虾超氧化物歧化酶活性影响结果相符。

本试验中日本沼虾不同组织T-SOD活性有一定差异，可能是T-SOD在日本沼虾中存在一定的组织特异性。在青鱼各组织中 SOD 含量大小依次为肝脏、鳃丝和肌肉［20］。孔祥会等［21］报道，T-SOD活性在锯缘青蟹（Scylla serrata）肝胰腺、肌肉和鳃中差异极显著。王伟伟［22］研究发现，克氏原螯虾中T-SOD含量从高到低依次是肝胰腺、肌肉和鳃，日本对虾中T-SOD含量从高到低依次是肝胰腺、肌肉和鳃，凡纳滨对虾中T-SOD含量从高到低依次是肝胰腺、鳃和肌肉。这些研究结果表明甲壳动物中T-SOD存在组织特异性，同时验证了本试验观点的合理性。另外，本试验结果显示，日本沼虾在感染停乳链球菌6 h后肌肉和鳃中T-SOD活性达到最大值，而肝胰腺5 d后达到最大值。产生这样的组织差异可能还因为，本试验停乳链球菌是通过肌肉注射的，所以短时间内肌肉中T-SOD活性首先被激活增强，且肌肉中T-SOD酶活性峰值最高也就不足为奇了；而鳃由于裸露在外，是虾体抵御不良刺激的第一道防线，所以T-SOD在鳃中亦快速增加，从而提高虾体的免疫机能，而肝胰腺位于体内，所以其应答时间最长，其T-SOD活性于感染后5 d才达到最大值。

本试验研究了日本沼虾感染停乳链球菌后T-SOD的活性变化，有助于了解链球菌感染对日本沼虾生理生化的影响，对进一步研究SOD在甲壳动物机体中的免疫功能，以及对甲壳动物健康养殖和疾病防治等具有重要的参考价值。

4 结论

日本沼虾肌肉注射停乳链球菌注射6 h后，肌肉和鳃中T-SOD活性均达到最大值，注射5 d后肝胰腺中T-SOD活性达到最大值，10 d后最高浓度组（6 ×106CFU/mL）肌肉、鳃和肝胰腺中和次高浓度组（4 × 106CFU/mL）肌肉中T-SOD酶活性均降至对照组的近一半，其他各组均逐渐降至对照组水平。另外，肌肉组织中T-SOD的峰值远高于鳃和肝胰腺组织中的峰值。

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（责任编辑 李楠）

Effect of Streptococcus dysgalactiae equisimilis on Total SOD Activity in Macrobrachium nipponense

Zhao Weihong1，2Zhang Fengying3Yu Yebing1，2Wang Zisheng1，2Qi Zhitao1
（1. School of Marine and Bioengineering，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224051；2. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Coastal Pond Aquaculture Ecology，Yancheng，224051；3. East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Science，Shanghai 200090）

Total superoxide dismutase（T-SOD）activities were investigated in hepatopancreas， muscle and gill of Macrobrachium nipponense at 3 h， 6 h， 9 h， 12 h， 24 h， 5 d and 10 d after being challenged by Streptococcus dysgalactiae equisimilis at levels of 0.6×106， 2×106，4×106or 6×106CFU/mL in this study. Results showed that activity of T-SOD in hepatopancreas of the prawn reached the maximum at 5 d after infection. The values in muscle and gill reached to a maximum at 6 h. The activities of T-SOD in the hepatopancreas and gill of prawns infected with 6×106CFU/mL bacteria， in the muscle of prawns infected with 4 × 106or 6 × 106CFU/mL bacteria at 10 d decreased to about half of that in the control group. And the maximum in muscles was higher than those in hepatopancreas and gills. The results showed that Streptococcus dysgalactiae equisimilis could affect the activity of SOD in M. nipponense， and the response of the prawn to the bacteria was different in hepatopancreas， muscle and gill.

Streptococcus dysgalactiae equisimilis；Macrobrachium nipponense；total superoxide dismutase（T-SOD）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.032

2014-08-20

国家自然科学基金项目（31101887），江苏省自然科学基金资助项目（BK2011419，BK2012675）

赵卫红，女，副教授，博士，研究方向：水产经济动物繁殖生理与营养；E-mail：misszwh@163.com

张凤英，女，副研究员，研究方向：水产生物遗传育种；E-mail：zhangfy76@126.com