固相反硝化系统中微生物群落结构的研究进展

张兰河左正艳，王旭明

（1.东北电力大学化学工程学院，吉林132012；2.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心，北京 100097）

固相反硝化系统中微生物群落结构的研究进展

张兰河1左正艳1，2王旭明2

（1.东北电力大学化学工程学院，吉林132012；2.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心，北京 100097）

固相反硝化是一种新型的异养反硝化工艺，采用固体有机物同时作为反硝化微生物的碳源和生物膜载体，可用于地下水和低C/N比污水的脱氮处理。固相反硝化系统生物膜的微生物群落结构决定固体碳源的降解效率，进而决定反硝化脱氮的速率和系统的稳定运行。因此，微生物群落结构的研究对于固相反硝化工艺的优化以及反应机理的解析具有重要意义。对不同固相反硝化系统微生物群落结构的研究现状和进展进行了综述，并探讨了当前研究中存在的问题和发展趋势。

固相反硝化；硝酸盐；生物膜；微生物群落

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.006

生物反硝化是自然界氮素循环的关键步骤之一，并在水源水［1，2］及污水［3，4］的脱氮处理中得到了广泛应用。生物反硝化主要由异养微生物利用硝酸盐作为电子受体，使之逐步还原为氮气的生物学过程。在污水脱氮处理过程中，有机物是异养微生物进行新陈代谢的必要物质和能量来源，因此，碳源是决定反硝化进程及系统脱氮能力与效率的关键因素［5］。对于地下水和低C/N比污水的生物脱氮来说，需要外加碳源作为电子供体才能保证反硝化的顺利进行。我国大部分污水厂都存在碳源不足的问题［6］，因此，适宜碳源的选择对于污水的生物脱氮具有重要的现实意义。

常规反硝化工艺通常加入甲醇、乙醇和乙酸等可溶性有机物作为补充碳源［7］。虽然可溶性碳源具有反硝化速率高，成本低的优点，但存在碳源容易过量影响出水水质的风险，尤其在进水硝酸盐有波动的情况下，碳源投加量的调控更加困难［8］。为克服上述弊端，人们尝试采用非水溶性固体有机物同时作为反硝化微生物的碳源和生物膜载体，实现污染水体的反硝化脱氮，这种工艺称为“固相反硝化（Solid-phase denitrification）”［9］。该工艺无需复杂的碳源投加控制系统，操作简单，运行稳定［10］。目前，固相反硝化工艺已成功应用于地下水［11，12］、低C/N比污水［13］及水产养殖系统［14，15］中硝酸盐的去除。

在固相反硝化工艺中，微生物在碳源表面的定植并形成稳定的生物膜是决定反硝化的限速步骤［1］，而且生物膜中的微生物组成决定固体碳源的分解及反硝化脱氮的效率。因此，全面了解固相反硝化系统的微生物群落结构与功能菌群，对于优化反应器的设计，改善系统脱氮性能，揭示反应机理都具有重要意义［16］。本文针对不同固体碳源反硝化系统的微生物群落结构研究进展进行综述，并展望未来的研究趋势。

1 不同固体碳源反硝化系统的微生物群落结构

1.1 PHAs反硝化系统

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHAs）是微生物自身合成的一种细胞内聚酯，是一种天然的高分子材料。PHAs家族中的聚羟基丁酸（Polyβ-hydroxybutyrate，PHB）和聚羟基丁酸戊酸共聚酯［poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate），PHBV］ 因具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的热加工性能，成为近年来生物材料领域最为活跃的研究热点。PHBV在20世纪80年代就已经实现了商品化生产（商品名为Biopol）［17］。在水污染控制领域，PHB和PHBV可用作固体碳源去除地下水［11］、循环水产养殖系统［18］中的硝酸盐。随着PHBV生产规模及其应用范围的不断扩大，价格也逐渐降低，这为PHBV在水体脱氮领域的大规模应用提供了可能［18］。

最早利用PHB和PHBV进行反硝化脱氮的是德国斯图加特大学的Müller等［19］，他们报道了一种填充PHBV颗粒的升流式固定床反应器，这种反应器表现出较高的反硝化速率，但当时并没有对反应器微生物的群落结构进行分析。Mergaert等［20］首先采用传统的纯培养方法，从PHBV反硝化系统中分离到186株异养细菌，分别属于Acidovorax、Pseudomonas、Agrobacterium、Alcaligenes、Afipia、Phyllobacterium、Stenotrophomonas和 Brevundimonas等。其中Brevundimonas属的菌株所占比例最高（30.6%）；其次为Pseudomonas（18.8%）和Acidovorax（6.5%）。研究还发现，反应器顶部和底部的微生物在分类地位和潜在功能上具有显著差异。例如，分离到的35株Pseudomonas有34株存在于反应器的下部，而所有Acidovorax facilis（12株）和Alcaligenes spp.（7株）都只存在于反应器上部。随后，Khan等［21］从PHBV为碳源的反应器中分离鉴定了50株占优势的异养反硝化细菌，包括Brevundimonas、Paracoccus、Acidovorax、Aquitalea、Brachymonas、Castellaniella、Comamonas、Diaphorobacter、Simplicispira、Klebsiella和Pseudomonas共11个属。以上分离菌株均属于变形菌门（Proteobacteria），其中90%属于β-变形菌纲（Betaproteobacteria），尤其是丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）为反应器的主要反硝化类群（占70%）。以上所有分离菌株都能利用乙酸盐和3-羟基丁酸作为碳源进行反硝化，但只有2个属（Comamonas和Diaphorobacter）的菌株能利用PHBV作为碳源进行反硝化。平板计数的结果表明，反应器中可培养的异养细菌（108左右）有83%具有反硝化能力，而能够降解PHBV的反硝化细菌（106-107）只占反硝化细菌总数的4.5%左右。以上研究结果表明，PHBV反应器中的反硝化细菌大多不能降解PHBV，但是能利用PHBV的降解产物乙酸盐和3-羟基丁酸作为碳源进行反硝化。因此，利用具有PHBV降解能力的高效反硝化菌株作为接种物，将会提高系统的脱氮效率，有助于实现PHBV在污水反硝化脱氮领域的工程应用。自然界中具有PHBV降解或反硝化功能的微生物类群很多，但同时具备上述两种功能的微生物并不多见。表1列出了目前已知能降解PHBV的反硝化细菌，其中Diaphorobacter nitroreducens NA10B是反硝化效率最高的PHBV降解菌，该菌株以PHBV为唯一碳源的反硝化速率为19 mg N/（g·h）［26］。

近年来，分子生态学技术开始被用于固相反硝化系统微生物群落结构的分析。徐影等［27］采用PCR-DGGE技术分析了PLA/PHBV（聚乳酸/聚羟基丁酸戊酸共聚酯）填充床反硝化反应器微生物群落结构的动态变化。在反应器的运行初期，固体碳源PLA/PHBV颗粒表面生物膜中的微生物多样性下降明显，但功能微生物的相对丰度增加。当反应器稳定运行时，DGGE图谱中特征条带的香农威尔指数和辛普森指数均变化不大，微生物群落结构保持相对稳定，这是反应器能够稳定运行的直接原因。反应器稳定运行时，Diaphorobacter为生物膜中最优势菌群。此外，生物膜还包括Acidovorax、Rubrivivax、Azospira、Thermomonas、Devosia几个属的菌株，以上菌株均属于变形菌门（Proteobacteria）都可以进行反硝化，但只有Diaphorobcter和Acidovorax两个属的菌可以通过自身合成的PHBV解聚酶降解PHBV［28］。张兰河等［25］在常规循环水养殖系统中加入一个以PHBV为碳源的反硝化单元，能有效控制养殖系统的硝酸盐浓度。反应器生物膜细菌归属于变形菌门（包括Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Deltaproteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。反应器运行初期（40 d）的优势种群主要为Acidovorax和Bacillus；运行后期（150 d）的优势种群依次为 Clostridium、Desulfitobacterium、Dechloromonas、Pseudoxanthomonas和Flavobacterium。虽然，该研究发现PHBV反应器的微生物组成比其他的PHBV反应器复杂，但并未发现其他PHBV反硝化系统常见的优势菌群Diaphorobacter，这可能与反应器进水的水质不同有关。

表1 降解PHBV的反硝化细菌

综上所述，PHBV反硝化系统中，变形菌门的β-变形菌纲（Betaproteobacteria）是主要的微生物类群，尤其是以活性污泥作为接种物的反应器［20，21，26，27］。在反应器运行的不同阶段，微生物的群落结构存在一定差异，但随着反应器的连续运行，微生物群落结构逐渐达到稳定，其中大多数微生物可以利用PHBV的降解产物乙酸盐和3-羟基丁酸作为碳源进行反硝化。Diaphorobacter nitroreducens NA10B是从PHBV系统分离到的反硝化速率最高的PHBV降解菌［26］。

1.2 PCL反硝化系统

聚己内酯（Polycaprolactone，PCL）是一种人工合成的聚合物，因具有优越的可生物降解性、生物相容性和力学性能而得到了广泛关注，并获得美国FDA的批准。1993年由美国Union Carbide公司实现商业化生产，商品名为TONE。与PHAs相似，PCL也可作为固体碳源用于低有机污染水的脱氮处理［29］。最早利用PCL进行反硝化研究的是德国斯图加特大学的Boley等［8］，该团队利用PCL作为碳源，有效去除了循环水产养殖系统中过量的硝酸盐，为循环水产养殖系统的硝酸盐控制提供了一种简单方法。

最早对PCL反硝化系统微生物组成进行研究的也是Boley等［30］，他们利用PCL作为碳源去除饮用水中的硝酸盐和农药硫丹，并从反应器中分离出246株细菌，通过脂肪酸分析将这些细菌大致分为5个 属：Acidovorax、Pseudomonas、Brevundimonas、Kocuria和Micrococcus。其中Acidovorax为反应器的优势种群，Acidovorax facilis占分离菌株总数的78%。从以上结果可以看出，PCL反硝化系统与PHBV反硝化系统的主要微生物组成相近，这可能是因为二者均为聚酯类，其水解均受酯酶催化的缘故。除了以上主要细菌类群之外，还存在22株脂肪酸特征相近的细菌无法确定分类地位。Mergaert等［31］根据这22株细菌的生理生化特征和DNA的G+C含量，以及DNA杂交的结果，提出以上菌株属于Thermomonas属的2个新种：T. fusca和T. brevis。

自2005年以来，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的高通量测序技术（第二代测序技术）相继诞生［32］，并很快在环境微生物群落的研究中得到了应用［33］。Chu等［12］利用454焦磷酸测序技术分析了PCL反硝化系统的微生物多样性，其中变形菌门丰度最高，占80%以上，此外还存在绿菌门（Chlorobi）（5.2%）、拟杆菌门（2.3%）、厚壁菌门（0.7%）、螺旋体门（Spirochaetes）（0.3%）、绿弯菌门（Chloroflexi）（0.3%）和酸杆菌门（Acidobacteria）（0.2%）。从属的水平来看，PCL反硝化系统中Diaphorobacter的相对丰度最高（19.45%）， 其 次 是Hydrogenophaga（3.94%）、Rhodocyclaceae uncultured（1.37%）、Desu-lfovibrio（1.09%）等。Wu等［34］的研究也得到了相似的结果，但在属的水平上存在差异，他们发现PCL反硝化系统中相对丰度最高的是Alicycliphilus（8.36%），其次为Diaphorobacter（4.59%）。这可能与反应器接种污泥的来源与菌群组成不同有关。以上关于PCL反硝化系统高通量测序的结果都表明变形菌门中的β-变形菌纲丰度最高，但Horiba等［35］利用荧光原位杂交（FISH）技术发现PCL反硝化系统中α-变性菌纲的丰度最高，其次为β-变形菌纲。这可能与采用的分子生态学研究手段不同有关［35］。

与其他的可生物降解聚合物相比，淀粉是一种丰富的可再生的多聚糖，并且具较高的生物可降解性能和低廉的价格，而PCL又具有热稳定性和空间稳定性。Shen等［36］将二者交联形成S-PCL（Starch-polycaprolactone）作为碳源进行反硝化脱氮，利用454焦磷酸测序技术发现生物膜微生物主要包括6大类：变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、螺旋体门和放线菌门（Actinobacteria）。变形菌门丰度最高可占到85.05%，其中β-变形菌纲占变形菌门的82.39%，表明β-变形菌纲是生物膜中的优势种群。从属的水平来看，S-PCL生物膜中微生物包括58个属，但有53.42%的序列不能归入已知的属。可鉴定相对丰度最高的15个属（占可鉴定属的93.79%）依次为：Diaphorobacter、Acidovorax、Dechloromonas、Alicycliphilus、Roseiflexus、Prevotellaceae uncultured、Treponema、Cloacibacterium、Pectinatus、Stenotrophomonas、Cellulomonas、Desulfovibrio、Azospira、Flavobacterium和Anaeroarcus。其中Diaphorobacter和Acidovorax共占可鉴定属总数的52.75%。S-PCL系统与PCL反硝化系统的高通量测序结果略有不同［12，34，36］，这可能与S-PCL碳源中含有易降解的淀粉有关。

1.3 PBS反硝化系统

聚丁二酸丁二醇酯［poly（Butylene succinate），PBS］是一种性能优良的脂肪酸聚酯，干燥环境中稳定，在泥土、海水及堆肥中能完全降解，因此可在较长的贮存和使用期内保持性能稳定，而使用后降解产物无毒。董明来等［37］利用PCR-DGGE技术研究了PBS作为碳源时反应器微生物组成的动态变化。结果表明，PBS生物膜中微生物的多样性逐渐增加，当反应器对硝酸盐的去除效果达到稳定时，生物膜的微生物群落组成也达到稳定。PBS生物膜中微生物所占比例分别是：变形菌门93.75%，厚壁菌门6.25%，其中变形菌门中β-变形菌纲占到60%、λ-变形菌纲33.4%、α-变形菌纲6.6%。β-变形菌纲中丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）和红环菌科（Rhodocyclaceae）是主要的功能菌群。

Wu等［38］采用454测序技术研究了PBS反硝化系统的微生物群落结构发现，3大类菌群占整个微生物群落的96.09%，包括变形菌门（88.35%）、拟杆菌门（3.23%）和绿弯菌门（4.51%）。PBS生物膜中可鉴定到属水平的微生物只占总数量的20%左右，其中反硝化细菌的比例达到13.02%，主要包括Diaphorobacter、Acidovorax、Dechloromonas、Alicycliphilus、Desulfovibrio、Azospira、Thauera、Simplicispira和Hydrogenophaga。

1.4 其他固体碳源反硝化系统

有很多研究者以农林废弃物，如植物秸秆、玉米芯、棉花等作为固体碳源进行反硝化脱氮。Wang等［39］利用玉米芯作为碳源同时去除地下水中的硝酸盐和5-氯酚，证实了5-氯酚在反硝化条件下的生物降解作用。该研究者还利用可降解餐盒作为碳源同时去除硝酸盐与4-氯酚［40］，实现了硝酸盐与4-氯酚的同时去除。但是以上研究都没有进一步研究反硝化系统的微生物组成。王小娇等［41］利用玉米芯作为碳源，结果发现以玉米芯为载体的生物膜优势菌群变化规律与生存环境的变化密切相关：当水体溶解氧水平较低时，生物膜上的优势种群以兼氧/厌氧的梭状芽孢杆菌（Clostridium）等反硝化异养菌为主；当水体中溶解氧提高后，生物膜上的优势种群以好氧/兼氧的异养杆状细菌——芽孢杆菌属（Bacillus）为主，而且这些菌体内均含有硝酸盐还原酶。

范振兴等［42］研究了聚乳酸（Polylactic acid，PLA）颗粒作为反硝化碳源的可行性。研究发现PLA作为碳源需要较长的驯化时间（40 d），这是因为相比PHBV和PCL，PLA更难生物降解［42］。利用扫描电镜观察到PLA颗粒表面生物膜以球菌为主，但该研究没有对生物膜的微生物进行鉴定。

Masaaki等［43］探讨了PLA分子量对反硝化脱氮的影响。使用重均分子量（Mw）为9 900 g/mol的PLA，其反硝化速率（3.5-5.3 mg N/g·h）远高于分子量为12 000和45 100 g/mol的PLA（0.03-0.45 mg N/g·h）。通过PCR-DGGE技术和16S rRNA基因克隆文库对PLA系统微生物的群落结构进行了分析，主要菌群及其相对丰度为：变形菌门50%，拟杆菌门28.3%，厚壁菌门13.7%，浮霉菌门5.6%，绿弯菌门1.6%，疣微菌门0.8%。变形菌门是系统中的优势类群，尤其是β-变形菌纲丰度最高，其中的丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）是主要的反硝化细菌并且可以利用PLA的水解产物。该研究没有从反应器中分离到能降解PLA的微生物，研究者认为可能是非生物因素使PLA水解为乳酸盐，然后反应器中的微生物以PLA的降解产物为碳源进行反硝化。此外，也可能是反应器中PLA降解菌的丰度太低，纯培养的方法难以有效分离。尽管PLA反硝化系统的优势微生物类群与PHBV反硝化系统相同，均为变形菌门，但其微生物群落组成要比PHBV系统的复杂，如浮霉菌门和疣微菌门并没有在PHBV为碳源的反硝化系统中发现。

2 小结

固相反硝化系统的微生物群落结构决定固体碳源的降解和反硝化速率。因此，关于系统中微生物群落结构与功能的解析是固相反硝化工艺的核心问题。尽管PCR-DGGE、454焦磷酸测序等现代分子生态学技术已经成功应用于固相反硝化系统微生物组成的分析，但现有研究只针对于nir，nor等反硝化基因［21］或部分16S rRNA基因序列［27，34］的分析，难以全面准确地揭示生物膜微生物群落结构及功能的深度信息［44］，尤其是缺少微生物在种水平上的详细信息［45］。通过对生物膜总DNA进行宏基因组学分析，可为上述问题提供有效的解决方案［46］。

此外，现有研究只针对固相反硝化系统中的细菌，至于固相反硝化系统中是否存在真菌和古菌，以及真菌和古菌的群落结构还缺少相关研究。Shen等［36］的研究尽管发现在固相反硝化系统中存在真核微生物，但没有确定这些真核微生物的分类地位。通过真菌和古菌的特异引物对生物膜样品进行基因扩增和测序，可望揭示固相反硝化系统中真菌和古菌的组成，从而为全面解析固相反硝化系统的微生物群落结构，及其与碳源降解和反硝化功能之间的关系奠定基础。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Progress on Microbial Community Structure in Solid-phase Denitrification Systems

Zhang Lanhe1Zuo Zhengyan1，2Wang Xuming2
（1. School of Chemical Engineering，Northeast Dianli University，Jilin 132012；2. Beijing Agro-Biotechnology Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097）

Solid-phase denitrification（SPD）is a new type of heterotrophic denitrifying process， in which solid organic matters are used simultaneously as carbon source and biofilm support. SPD process has been applied on nitrogen removal from groundwater and wastewater with the low ratio of carbon to nitrogen. Microbial community structure in SPD system determines not only degradation efficiency of solid carbon source but also denitrification rate and stable running of the SPD system. Therefore， the research on microbial community structure is significant for the optimizing SPD process and exploring its mechanism. This review summarized the present research status and progress on microbial community structure in different SPD systems. In addition， the main problems and the new perspectives in the present study were also discussed.

solid-phase denitrification；nitrate；biofilm；microbial community

2014-04-23

国家自然科学基金项目（21077014），北京市科技计划课题（Z121100001512008），北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX20140420，KJCX201204006），吉林省科技发展计划项目（20150519020JH）

张兰河，男，博士，研究方向：水污染控制技术；E-mail：zhanglanhe@163.com

王旭明，男，博士，副研究员，研究方向：环境生物技术；E-mail：wangxuming@baafs.net.cn