丝状真菌PCR模板DNA的快速制备方法

罗中钦程琳张茜陈国华

（1.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京　100081；2.山西师范大学生命科学学院，临汾　041004；3.　北京师范大学生命科学学院，北京　100875）

丝状真菌PCR模板DNA的快速制备方法

罗中钦1程琳2张茜3陈国华1

（1.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081；2.山西师范大学生命科学学院，临汾041004；3.北京师范大学生命科学学院，北京100875）

以尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）为材料，旨为建立沸水浴获得PCR模板DNA的新方法。】取少量真菌菌丝置于一定体积50 mmol/L NaOH溶液中沸水浴10 min，再加入1/10体积1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液，12 000 r/min离心后，上清用作PCR的DNA模板。结果显示，该方法扩增效率高，扩增条带清晰，且Taq酶适应性强，适合快速制备丝状真菌的模板DNA。该方法经济、简单、快速、安全高效，可用于丝状真菌转化子的高通量筛选和菌株的快速鉴定。

丝状真菌；尖孢镰刀菌；PCR扩增；Taq DNA聚合酶

PCR技术，自1983 年美国人Kary Mullis发明以来，已经成为分子生物学及其相关领域最基本、最重要的技术方法。如今，从基因扩增与基因检测到基因克隆、基因改造、遗传分析等都已离不开PCR技术［1，2］。另外，在病原微生物检测、法医鉴定、考古研究食品安全及品种鉴定等多领域PCR技术也发挥着重要作用［3-7］。

PCR方法的前提条件是获得DNA或RNA反转录的cDNA模板。DNA的提取方法主要有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfonate，SDS）提取法［8］和十六烷基三乙基溴化铵（Hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）提取法［9］，或者直接从试剂公司购买提取试剂盒。这些方法虽能得到较高质量的DNA，但需样品量较大，且操作步骤较繁琐，效率低，难以满足对大量样品检测的需求。另外，对于样品检测实验需要的模板量少，常规DNA提取方法提取的大量DNA未被充分利用，造成了浪费。为解决以上问题，研究人员开发多种简单、快速的获得DNA模板的方法，如微量玻璃粉吸附、Chelex-100法、微波处理、TE缓冲液沸水煮、NaOH溶液处理等，通过处理植物叶片、真菌菌丝等样品获得模板DNA［10-16］。GE公司的Whatman FTA卡仅用一张卡片就可以完成室温下DNA和RNA的采集、运输、纯化和储存，为血样、口腔细胞、植物DNA等样本的保存和分析提供了简单、可靠的方法［17，18］。但是，这些方法多为传统方法的改良，程序较复杂或需要特殊的仪器、试剂或相关配套产品，因此成本较高。

对于丝状真菌而言，遗传转化子筛选和野外样本菌株鉴定往往需要对大量样本进行PCR扩增，且所需的DNA模板量又很少，而丝状真菌细胞壁结构复杂又无法使用普通的菌落 PCR［19，20］。因此，本研究以尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）为材料，结合前人研究成果，建立一种用于丝状真菌PCR模板DNA的快速制备方法，即利用NaOH溶液对丝状真菌的菌丝进行简单的沸水浴处理，再加入Tris-HCl中和即可得到适用于PCR 的 DNA 模板，该方法经济、简单、快速、高效，旨在为丝状真菌转化子的高通量筛选和分离菌株的快速鉴定提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验室保存的尖孢镰刀菌甘蓝专化型A8和其他丝状真菌菌株18个。尖孢镰刀菌和其他真菌菌株接种于含100 mg/L氨苄青霉素钠和头孢噻肟钠的PDA平板上，28℃培养4 d，备用。

1.2 方法

1.2.1 菌丝处理 取 4个1.5 mL离心管，分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，Ⅰ号离心管加入无菌水50 μL，Ⅱ号离心管加入1×TE缓冲液50 μL，Ⅲ号离心管加入100 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）50 μL，Ⅳ号离心管加入50 mmol/L NaOH溶液50 μL。用无菌牙签挑取少量菌丝到各离心管中，涡旋打散菌丝，沸水浴10 min。Ⅳ号离心管中再加入5 μL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液。12 000 r/min离心10 min。取上清至新离心管中，即为制备的模板DNA，-20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 以1.2.1得到的DNA为模板，SDS提取法得到的100 ng/μL DNA（CK+）和无菌水（CK-）分别为阳性和阴性对照，引物选用2对真菌检测的通用引物和10对尖孢镰刀菌特异引物（表1）。Taq DNA聚合酶选自于5家公司：天根Taq DNA polymerase（ 货 号：ET101-01-03）、TaKaRa Ex Taq（货号：RR001A）、全式金 Easy Taq DNA polymerase（货号AP111-01）、博迈德 Taq DNA polymerase（货号：PC0101）和康为世纪Taq DNA polymerase（货号：CW0680），编号为T1、T2、T3、T4和T5（编号顺序与上述提到的公司顺序无对应关系）。除酶适应性实验中用到5种酶外，其余均使用酶T1。PCR反应体系为20 μL：模板2.0 μL（模板用量实验中分别 用0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 μL），10×Taq buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，加ddH2O补足到20 μL。PCR反应程序为：95℃ 3 min；95℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，30个 循 环；72℃ 8 min。PCR反应完成后，向PCR产物中加入4 μL 6×loading buffer，混匀，取10 μL进行琼脂糖电泳检测，Marker为全式金trans2K Plus DNA Marker。

2 结果

2.1 不同方法制备的DNA模板PCR扩增效率比较

用4种方法制备的模板DNA进行PCR扩增，结果如图1所示。用1×TE缓冲液沸水浴（方法Ⅱ）制备的模板DNA和50 mmol/L NaOH溶液沸水浴后再加1/10体积1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液（方法Ⅳ）制备的模板DNA与阳性对照（CK+）扩增结果一致，2对通用引物及5对特异引物都能得到清晰的电泳条带，而100 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）沸水浴（方法Ⅲ）制备的模板DNA只有通用引物扩增得到了清晰的条带，特异引物扩增只得到微弱的条带，无菌水沸水浴（方法Ⅰ）制备的模板DNA只有18S rDNA通用引物得到微弱条带，其余引物均没有条带。所以，方法Ⅱ和Ⅳ所制备的模板DNA，用T1酶进行扩增，能得到理想的结果。

表1 PCR引物

图1 不同方法制备的尖孢镰刀菌DNA模板PCR扩增结果

2.2 DNA模板对Taq DNA聚合酶的适应性

用实验室常用的5个不同公司的Taq DNA聚合酶，以方法Ⅱ和Ⅳ所制备的DNA为模板进行PCR，结果如图2所示。方法Ⅳ得到的模板DNA用5个公司的酶扩增都能得到清晰条带，但条带亮度有所不同，而以方法Ⅱ得到的模板DNA，只有用T1酶才能扩增出条带。所以，方法Ⅱ所得到的模板DNA可以用来进行PCR检测，但需要选择活性较高的酶，做检测前需要进行预备实验，检验所用酶是否能用于该方法制备的模板DNA；而方法Ⅳ得到的模板DNA对酶的适应性较好，5种酶都可用，比方法Ⅱ更具优势。

图2 不同方法制备的尖孢镰刀菌模板DNA用不同Taq DNA聚合酶的PCR扩增结果

2.3 不同模板用量对PCR结果的影响

由于使用沸水浴制备的模板DNA都是微量的，无法准确测得其浓度，故而使用不同模板DNA溶液体积进行实验。用方法Ⅳ制备的模板DNA 0.2-8.0 μL进行PCR反应，结果（图3）显示，模板用量为2 μL时，条带最清晰，模板量高于或低于2 μL条带亮度减弱。这是由于该方法制备的模板DNA中含有其他杂质（如NaOH、Tris-HCl等），当加入的模板量高时会抑制Taq酶的活性，模板量低，DNA量少，条带也较弱。因此，使用方法Ⅳ制备的模板DNA时，用量控制在1-4 μL为佳。

图3 方法IV制备的尖孢镰刀菌不同模板DNA用量PCR扩增结果

2.4 不同大小片段的PCR扩增

以方法Ⅳ制备的DNA为模板，重新选用5对扩增片段大小不同的引物，进行PCR扩增，结果（图4）显示，扩增大小从396-1978 bp均得到单一清晰条带，片段范围已能满足真菌检测的需要。

图4 方法IV制备的尖孢镰刀菌模板DNA不同大小DNA片段的PCR扩增结果

2.5 方法Ⅳ在其他丝状真菌菌株鉴定中的应用

选用本实验室保存的丝状真菌菌株18个，挑取菌丝用方法Ⅳ制备模板DNA，扩增其18S rDNA和 ITS片段，结果如图5所示。18个菌株与阳性对照一样都能得到清晰单一的条带，说明方法Ⅳ除可以制备尖孢镰刀菌模板DNA外，对其他丝状真菌也可以制备适合PCR的模板。

图5 其他丝状真菌菌株18S rDNA及ITS扩增结果

3 讨论

本研究结果表明，方法Ⅳ可以制备优质的PCR模板DNA。实际应用中可以根据需要减少或加大NaOH溶液体积，再用1/10体积的1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中和即可，根据体积变化适当增加或减少菌丝量。

用NaOH溶液直接处理粗样品的方法在水稻、小麦和海洋浮游生物等研究中都有应用，如汪秀峰等［16］用250 mmol/L的NaOH溶液处理水稻叶片，处理过后用HCl和Tris-HCl中和，而后取出处理过的水稻叶片作为PCR模板，但该法每次PCR得用1小块叶片，加大了样品的使用量，同时也给PCR增加了额外的步骤；刘鹏等［13］用100 mmol/L的NaOH溶液处理小麦幼叶，但还需经酚氯仿抽提，异丙醇沉淀，比传统方法只是省去了液氮速冻和样品研磨，还不够简化；刘泳等［14］用125 mmol/L的NaOH处理海洋浮游生物，25℃处理8 h以上，然后99℃加热10 min，再加入HCl、Tris-HCl和TritonX-100混合，再次99℃加热10 min，此法虽简化了步骤，但是耗时过长。以上的方法与本研究建立的方法相似，但都不够简化，这可能与样品的复杂性相关，有些步骤不可或缺，否则无法达到PCR模板的要求。对于丝状真菌，陈吉良等［12］建立了一种用10%（W/V）的无菌 Chelex-100 树脂溶液经沸水浴制备PCR模板DNA的方法，但样品在处理前需要液氮适当研磨。此法步骤简单，但需要特殊试剂，成本相对较高；潘力等［15］也建立了一种微波处理置于 10 × TE 缓冲液中的菌丝获得DNA的方法，但未对该方法获得的模板DNA进行Taq DNA聚合酶适应性的研究，而本研究发现TE处理（方法Ⅱ）的样品具有Taq酶选择性，只适用于少数Taq DNA聚合酶。

相对于上述方法，本研究建立的方法具有以下优点：（1）直接从菌落挑取菌丝，不需要液体培养，不需要磨样，减化了实验步骤，大大减少了实验时间，同时也减少了被污染的几率；（2）不需使用液氮，只需普通的NaOH和Tris-HCl试剂，且用量少，仪器需要普通离心机、水浴锅或者电磁炉即可，成本低廉；（3）实验人员可避免接触酚、氯仿等毒性有机试剂，安全可靠。

4 结论

本研究以尖孢镰刀菌为材料，通过对4种方法的比较筛选，建立了一种快速制备丝状真菌PCR模板DNA的方法。该方法制备模板DNA，无需液氮和研磨，只需少量50 mmol/L NaOH溶液及1 mol/L Tris-HCl，沸水浴10 min及离心10 min即可，可采用实验室常用的各种Taq DNA聚合酶扩增出18S rDNA和ITS片段及400 bp-2 000 bp大小范围的特异片段。另外，本法也适用于其他丝状真菌，可为实验室大量丝状真菌的转化子及菌株的鉴定提供经济、 简单、 快速、 安全和高效的方法。。

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（责任编辑 狄艳红）

A Rapid M ethod of Preparing DNA Tem p late of Filamentous Fungi for PCR Am p lification

Luo Zhongqin1Cheng Lin2Zhang Xi3Chen Guohua1
（1. Institude of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081；2. College of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen041004；3. College of Life Science，Beijing Normal University，Beijing100875）

This work aims to establish a novel method of extracting DNA template of filamentous fungi for PCR amplification with boilingwater bath and Fusarium oxysporum as raw material. The procedures of this method are as the following：exposing the fungal mycelia in certain volume of 50 mmol/L NaOH solution under boiling water bath， adding 1/10 volume of 1mol/L Tris-HCl（pH8.0）buffer， centrifuging it at 12 000 r/min for 10 min， and using the supernatant as the DNA template for PCR amplification. Results demonstrated that the efficiency of PCR amplification with the DNA template prepared by the method was high， the amplified bands were clear， and adaptability to various Taq DNA polymerases was strong；This indicated that the method was suitable for the preparation of DNA template of filamentous fungi. Conclusively， this method is economic， simple， rapid， safe and high-efficient， and can be utilized for high-throughput screening of filamentous fungal transformants and rapid identification of isolated strains.

filamentous fungi；Fusarium oxysporum；PCR amplification；Taq DNA polymerase

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.010

2015-01-09

国家自然科学基金项目（31301618）

罗中钦，男，博士，研究方向：蔬菜病原微生物致病机理；E-mail：lzhqin@163.com

陈国华，女，博士，研究方向：蔬菜抗病育种；E-mail：chenguohua01@caas.cn