重组人白细胞介素-1α在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性检测

李斌 许晓亚 杨刚刚 崔晴晴 杨亚娟 徐存拴

（河南师范大学生命科学学院　河南省一科技部共建细胞分化国家重点实验室培育基地和河南省生物工程重点实验室，新乡　453007）

重组人白细胞介素-1α在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性检测

李斌 许晓亚 杨刚刚 崔晴晴 杨亚娟 徐存拴

（河南师范大学生命科学学院河南省一科技部共建细胞分化国家重点实验室培育基地和河南省生物工程重点实验室，新乡453007）

在毕赤酵母中分泌表达重组人白细胞介素-1α（rhIL-1α），优化rhIL-1α的发酵工艺及纯化方法，以获得高表达、高纯度具有生物学活性的rhIL-1α。通过PCR扩增获得hIL-1α基因，构建其真核表达载体pPICZαA/hIL-1α，电转化至毕赤酵母X-33，用PCR和SDS-PAGE方法筛选高效表达rhIL-1α的工程菌株并进行Western blot鉴定，DEAE 弱阴离子离子交换层析一步纯化表达产物，并用MTT法初步检测其对人肝癌细胞7402的生物学作用。rhIL-1α在摇瓶规模下，经甲醇诱导4 d后表达量约为30 mg/L。Western blot检测rhIL-1α的特异性结合，获得纯度约95%，收率40%左右的rhIL-1α，并证明rhIL-1α能够抑制人肝癌细胞7402的增殖。构建了重组hIL-1α的基因工程菌，并在毕赤酵母中实现了高效表达，为进一步研究其生物学活性和功能奠定了基础。

重组人白细胞介素-1α；毕赤酵母；表达；纯化；人肝癌细胞

1972年，Gery等从人白细胞的培养上清中提取得到一种可溶性物质，起初被命名为淋巴细胞激活因子或内源性热原质、破骨细胞刺激因子、黑素瘤细胞生长抑制因子等，在1979年被统一命名为白细胞介素-1（IL-1）［1］。IL-1按其结构不同分为IL-1α和IL-1β。IL-1α基因定位于2号染色体，含7个外显子，IL-1α的前体是由IL-1α基因合成的、无信号肽的31 kD分子。IL-1α前体被Ca2+依赖的钙蛋白激酶降解为17 kD的成熟体，等电点为5.3，IL-1β是由153个氨基酸以β-折叠的形式组成位于2号染色体，分子量约为17.5 kD，等电点为7.2。IL-1α和β在同一种属中两者的同源性只有20%-30%，但在不同种属间具有较高同源性，分别为60%-70%和75%-78%［2，3］。IL-1α具有很重要的研究意义和应用价值，文献报道IL-1α在白血病、肝癌、黑色素瘤、胃癌等在内的多种肿瘤中均有表达［4-6］，而其表达机制尚不清楚。临床试验表明，50 ng/kg IL-1α可治疗骨髓或干细胞移植期间早期血小板的减少［7，8］。头颈部临床试验III期发现，IL-1α具有重要的免疫治疗作用（Cel-Sci Corp）。

目前，IL-1α主要通过原核表达系统［9］制备，而真核表达系统尚未见报道。由于原核表达体系存在产量低，操作复杂，后期复性困难等问题。为得到表达量高、活性高的IL-1α，更好地研究IL-1α的特性和功能，本研究利用巴斯德毕赤酵母表达hIL-1α，在1 L摇瓶规模下对其进行表达条件优化和分离纯化方法探索，同时，对hIL-1α的活性进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

E.coli DH5α购自武汉晶赛生物工程技术有限公司，毕赤酵母X-33菌株和pPICZαA分泌型酵母表达载体购自Invitrogen公司，重组人白细胞介素-1α基因委托上海生工生物工程有限公司合成，兔多抗人IL-1α抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自Invitrogen公司，人肝癌细胞（Bel-7402）购自中科院上海细胞库，RPIM1640培养基购自Invitrogen公司，胎牛血清购自杭州天杭生物科技有限公司，MTT、DMSO购自Geneview公司，限制性内切酶Sac I、Bam H I和Eco R I等购自MBI公司，Protein Ladder购自北京康为世纪生物科技有限公司，考马斯亮蓝G-250（分析纯）购自中国医药公司，牛血清白蛋白（生化试剂）购自西安沃尔森生物技术有限公司，其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 人白介素-1α基因（hIL-1α）的设计及载体的构建 在GenBank上搜索得到IL-1α基因的全序列（NM_000575），通过查阅文献确定IL-1α蛋白的成熟序列，利用在线序列优化工具对IL-1α核苷酸序列进行人工优化（http：//www.evolvingcode.net），在不改变氨基酸序列的情况下，密码子替换为高频使用或次高频使用的密码子［10］。人工合成优化（终止序列调整、密码子优化并提高GC含量）后的IL-1α基因序列连接至T载体，进行测序，用Eco RⅠ/ NotⅠ双酶切IL-1α/pUC-T及质粒pPICZαA，回收目的基因片段和载体片段进行连接，连接产物转化至DH5α感受态，经蓝白斑筛选阳性克隆、提取质粒进行PCR和双酶切鉴定，结果正确后进行测序。以上操作由上海生工生物有限公司完成。

1.2.2 酵母分泌型表达载体的转化 重组表达质粒pPICZαA/hIL-1α以Sac I线性化，按毕赤酵母表达手册中电转化方法，将重组表达质粒转至毕赤酵母X-33感受态细胞，将转化的X-33涂于含100 μg/mL博来霉素（Zeocin）的YPD平板上，28℃培养3 d至长出菌落，在YPD平板上随机挑取8个克隆，扩大培养后提取酵母基因组DNA，以之为模板，PCR鉴定目的基因是否整合到酵母染色体。

1.2.3 rhIL-1α 摇瓶规模表达 随机挑取1个鉴定正确的菌种接种到10 mL YPG培养基/50 mL三角瓶中，于28℃、250 r/min摇床培养18-24 h，当OD值达到10时，取1 mL菌液，接种到100 mL BMGY培养基/1 L三角瓶中，于28℃、280 r/min继续培养24 h后，加入终浓度为1%（V/V）的甲醇进行诱导表达，培养条件调整为28℃、200 r/min。每12 h补加一次甲醇，补加量为发酵液体积的1%（V/V）。分别取诱导24、48、72、96、120、144、168h的发酵液于12 000 r/min离心15 min，取1 mL上清进行三氯乙酸（TCA）后，进行15%SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达。

1.2.4 rhIL-1α摇瓶发酵规模条件优化

1.2.4.1 最佳体积和转速试验 毕赤酵母是好氧微生物，溶解氧浓度对菌体的生长和产物的表达有很大的影响，溶氧过低会抑制菌体生长，过高则会促进菌体的新陈代谢加快，加速菌体死亡，造成蛋白过早降解，不利于目的蛋白积累。转速调节是改变发酵过程中溶解氧的重要方式，较高的转速会提高氧的体积系数，增加发酵液中氧的供给，但同时会加剧细胞的死亡速率，降低产物的表达量［11］。因此，我们设计了以下正交实验研究在1 L摇瓶条件下rhIL-1α诱导表达的最佳装液量和转速，参数设置如下：体积设置：100 mL、200 mL、300 mL；转速设置：100 r/min、200 r/min、300 r/min。以上实验每组设定3次重复，在诱导最佳时间进行取样，SDSPAGE电泳检测蛋白表达情况，确定诱导表达的最佳体积和转速。

1.2.4.2 最佳pH试验 酵母菌生长最适pH范围为3.0-7.0，pH过低会影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，过高则会抑制菌体中某些酶的活性［12］，通过调节初始pH值来考察pH对rhIL-1α表达的影响。本研究设定pH梯度为：4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。每组设定3次重复。

1.2.4.3 最佳温度试验 一般而言，毕赤酵母的最佳生长温度为28-30℃，当温度升高到32℃时毕赤酵母菌株不能正常生长，温度对毕赤酵母发酵产物的活性、发酵液的物理性质及合成方向等有重要的影响。研究表明，在发酵过程中，诱导表达时的温度低于菌体生长时的温度更加有利于蛋白的表达［13］。为此本实验对rh IL-1α温度优化为20℃、23℃、26℃、29℃。

1.2.4.4 最佳甲醇浓度试验 在毕赤酵母诱导表达过程中，甲醇作为诱导剂和碳源双重身份影响目的蛋白的表达，过低或者过高均影响目的蛋白的表达，因此合适的甲醇浓度是提高外源蛋白表达量的又一个关键因素。文献报道［14，15］，甲醇添加量一般为0.5%-1%。为了研究在1 L摇瓶条件下诱导表达的最佳甲醇浓度，本实验设置了0.25%、0.5%、0.75%、1%四个梯度。

1.2.5 rhIL-1α的分离纯化 取诱导4 d的发酵液于4℃，4 000 ×g离心30 min，收集上清进行10 kD超滤浓缩。取蛋白浓缩液进行DEAE弱阴离子交换层析柱进行纯化。用buffer A（10 mmol/L Na2HPO4pH8.0）平衡柱子，样品以1 mL/min的流速流穿离子交换树脂，然后用buffer B（buffer A中含有0-500 mmol/L NaCl pH8.0）进行梯度洗脱，紫外检测仪监控，收集各洗脱峰，SDS-PAGE进行检测。

1.2.6 rhIL-1α蛋白免疫印迹检测 蛋白免疫印迹按Towbin等方法［16］进行。rhIL-1α进行SDS-PAGE后，将rhIL-1α转移到PVDF膜上，用IL-1α兔多抗一抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，超敏ECL底物发光显色，用Typhoon 7500扫描仪和图像定量软件进行定量分析。

1.2.7 考马斯亮蓝法（Bradford）测定蛋白浓度 以纯的牛血清白蛋白作为标准品，取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL标准品于10 mL试管中，加水至1 mL，然后加入4 mL的G-250溶液，混匀，静止10 min，在595 nm处测其吸光值制定标准曲线［17］。取样品溶液0.2 mL，做3个重复，以水作空白对照，测其吸光值，并计算蛋白浓度。

1.2.8 rhIL-1α的生物学活性检测 人肝癌细胞7402（Bel-7402）于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，取对数生长期的细胞，于3 000个/孔接种至96孔板中培养12 h，待细胞贴壁后弃培养基，更换含有不同浓度rhIL-1α（0、5、10、15、20 ng/mL）的培养基，每组设3个平行孔。继续培养72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，于培养箱中培养4 h，弃掉培养基，每孔加入DMSO 150 μL，摇动培养板5 min，使细胞内结晶全部溶解，用Biotek reader酶标仪在490 nm处测其吸收值，检测rhIL-1α对Bel-7402细胞增殖的影响。

2 结果

2.1 重组质粒pPICZαA/hIL-1α的构建和鉴定

用碱裂解法提取hIL-1α质粒，并分别进行单双酶切和PCR扩增，1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果（图1）显示，重组质粒经SacⅠ单酶切后出现一条5 kb左右条带。Bam H I和Eco RⅠ双酶切后出现4 kb和500 bp左右的2条带。用载体通用引物进行PCR扩增出现一条1 kb左右的特异性扩增条带，与预期片段大小一致，经上海生工生物公司测序证明其序列正确。

图1 rh IL-1α三种不同表达载体质粒鉴定结果

2.2 rhIL-1α的表达与鉴定

重组表达质粒pPICZαA/hIL-1α转化毕赤酵母菌X-33后，在YPD平板上随机挑取8个克隆扩大培养，提取基因组后进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳分析（图2-A），8个转化子在1 000 bp位置均出现预期条带，证明hIL-1α基因已经整合到酵母基因组中。对鉴定正确的重组菌株进行1L规模摇瓶筛选，取不同时间表达上清进行SDS-PAGE检测和Western blot鉴定，结果（图2-B）显示，在相对分子质量约17 kD处出现考马斯染色条带，与hIL-1α的分子量一致，且在甲醇诱导第4 天表达量最高。经Western blot鉴定（图2-C），目的条带均有阳性反应，说明rhIL-1α正确表达。

图2 rh IL-1α鉴定结果

2.3 rhIL-1α摇瓶条件的优化

2.3.1 培养基体积和转速对rhIL-1α的影响 取X-33/pPICZαA/hIL-1α菌株进行活化培养，当OD600值达到10时，将菌种分别接种于不同体积BMGY（100、200、300 mL）培养基中，于28℃，280 r/min摇床振荡培养至OD600=2-6，分别取3瓶含100、200、300 mL培养基的三角瓶放于100 r/min的摇床培养；剩余6瓶分别放于200 r/min和300 r/min摇床培养（表1），每隔12 h添加甲醇至终浓度为1%，诱导4 d，取1 mL上清进行TCA处理后，SDSPAGE电泳检测（图3）发现，随着体积的增大，蛋白表达量降低，当转速为200 r/min时，蛋白表达量优于100 r/min和300 r/min。rhIL-1α发酵培养最佳体积和转速为100 mL/L，200 r/min。

表1 培养基体积和转速对rh IL-1α表达的影响

图3 培养基体积和转速对rh IL-1α表达的影响

2.3.2 pH对rhIL-1α表达的影响 分别取1 mL菌液，接种到pH为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的BMGY培养基进行培养，SDS-PAGE检测（图4）表明，当pH＜5.5时，随着pH的降低，蛋白的表达量逐渐下降，当pH＞5.5时，随着pH的增大，蛋白的表达量显著降低，在pH5.5时，rhIL-1α的表达量最高。

图4 不同pH对rh IL-1α的影响

2.3.3 温度对rhIL-1α表达的影响 rhIL-1α培养进入诱导阶段时，培养温度分别更改为20、23、26、29℃，诱导96 h后，取发酵液进行SDS-PAGE检测，结果（图5）表明，当温度为29℃时，重组蛋白的表达量最低，当温度为26℃时，rhIL-1α表达量最高。

图5 不同温度对rh IL-1α的表达影响

2.3.4 甲醇浓度对rhIL-1α表达的影响 rhIL-1α进入诱导期后，在26℃，200 r/min下培养，甲醇浓度分别设为0.25%、0.5%、0.75%、1.0%，结果如图6所示，随着甲醇浓度的增加，重组蛋白的表达量随着提高，当添加甲醇浓度为1%时，rhIL-1α的产量达到最高。

图6 不同甲醇浓度对rh IL-1α的影响

2.4 rhIL-1α的分离纯化

取诱导4 d发酵液，经过离心→10 kD膜包浓缩→DEAE弱阴离子交换层析方法。收集各洗脱峰，SDS-PAGE检测发现，在100 mm NaCl处可以洗脱下单一的目的蛋白（图7）。蛋白纯度为95%，经Bradford法测定，蛋白收率为40%左右。

图7 rh IL-1α各步分离纯化SDS-PAGE分析

图8 不同浓度rh IL-1α对Bel-7402细胞的影响

2.5 rhIL-1α抑制人肝癌细胞7402的增殖

不同浓度的rhIL-1α处理Bel-7402细胞后，MTT法检测细胞的活力，结果如图8所示，10 ng/mL rhIL-1α处理细胞72 h后，与对照比有显著的差异（P＜0.05），当rhIL-1α的浓度为15、20 ng/mL时，与对照比有极显著差异（P＜0.01）（图8），表明rhIL-1α对人肝癌细胞7402具有一定的杀伤力，能抑制癌细胞的增殖生长。

3 讨论

IL-1α作为重要的促炎性细胞因子参与多种生理活动，如修复、增殖、凋亡、细胞迁移、分化、细胞坏死等，在角膜受损研究中发现，IL-1α参与到NF-κB信号通路调控受损角膜的修复［18］。在非小细胞肺癌的胸腔积液中IL-1α处于一个高表达水平，它可作为潜在诊断非小细胞肺癌的生物标志物［19，20］。研究表明，当人永生化角质形成细胞（HaCaT）受中波紫外线（UVB）照射时，细胞分泌大量的IL-1α，IL-1α下调HaCaT细胞水通道蛋白3（AQP3）的表达，这一作用可能和皮肤光老化的发生有关［21］。李树等［22］的研究发现，在小鼠皮肤受损修复过程中，IL-1α在受损早期有一次表达高峰，IL-1α可作为损伤早期时间推断的一个指标。因此，IL-1α在组织受损、肿瘤、自身免疫性疾病等方面具有重要的潜在临床研究价值。

本实验选用毕赤酵母野生型X-33菌株，它具有生命力强、无回复突变、分泌能力强、能在YPD和最小规模培养基中生长等优点［23］。根据酵母在密码子上使用偏爱性，在不改变氨基酸序列的情况下，通过调整终止序列、提高GC含量对hIL-1α序列进行优化，把hIL-1α的成熟肽连在α-交配因子信号肽的C端，AOX1启动子诱导hIL-1α在毕赤酵母中分泌表达。蛋白产量与发酵条件密切相关，为此，本实验分别从装液量、转速、温度、pH、甲醇浓度5个方面对rhIL-1α的发酵条件进行优化。研究表明，装液量和转速直接影响培养基中溶解氧的浓度，在发酵过程中，溶解氧浓度对外源蛋白的表达具有十分重要的影响，过高或过低都不利于蛋白的表达［24，25］。实验结果显示，在装液量为100 mL/1 L，转速200 r/min时，蛋白表达量最高，过多的装液量和过高的转速均不利于蛋白的表达。也有研究表明，适当的升高温度，有利于细胞的生长代谢和蛋白的表达，但温度过高会使菌体提早衰老，降低蛋白的表达量［26］。本实验从20-29℃对rhIL-1α的表达进行研究发现，随着温度的升高，蛋白产量增加，当温度＞26℃时，蛋白产量随着下降。因此，在诱导阶段适当的降低温度可以减少菌体的死亡，同时也可保护蛋白不被降解［27］。pH是影响蛋白表达的又一关键参数，适宜的pH不仅有利于蛋白的表达，同时也可防止蛋白酶降解，易于后续的纯化工作。结果表明，pH为5.5时，最有利于rhIL-1α的表达。在发酵过程中，定时定量地补加甲醇对蛋白的表达具有至关重要的影响［14，25］。过低不够蛋白的表达，过高则会导致菌体死亡，降低蛋白产量。本研究发现，随着甲醇浓度的升高，蛋白产量随着增加，在1%时产量达到最多。

本研究用毕赤酵母表达hIL-1α，仅用一步层析纯化，获得纯度高达95%以上的重组蛋白。与原核表达体系相比，减少了破壁、复性等复杂的纯化步骤，提高蛋白的收率，降低了生产成本。对纯化后的rhIL-1α进行活性检测发现，rh IL-1α能抑制Bel-7402细胞的增殖，与文献报道一致［21，28，29］。本研究为深入探讨IL-1α功能机理提供了良好的条件，同时也为其产业化生产奠定了坚实的基础。

4 结论

成功构建了rhIL-1α的毕赤酵母表达体系，对其摇瓶发酵条件进行了优化，最适的发酵条件为装液量为100 mL/1 L摇瓶、初始pH为5.5、诱导转速200 r/min，诱导温度为26℃，甲醇添加量为1%，每12 h补加一次，诱导4 d，最终获得rhIL-1α的最高产量约30 mg/L，较优化前提高了47.9%。用DEAE弱阴离子交换层析一步法对其进行纯化，得到纯度高达95%，得率约40%，能抑制Bel-7402细胞增殖的rh IL-1α。

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（责任编辑 李楠）

Expression，Purification and Bioactivity of Recombinant Human Interleukin-1α Expressed in Pichia pastoris

Li Bin Xu Xiaoya Yang Ganggang Cui Qingqing Yang Yajuan Xu Cunshuan
（State Key Laboratory Cultivation Base for Cell Differentiation Regulation and Henan Bioengineering Key Laboratory，Henan Normal University，College of Life Science，Henan Normal University，Xinxiang453007）

This work is to secret and express human interleukin-1α（rhIL-1α）in Pichia pastoris and optimize the fermentation and purification process of rhIL-1α for obtaining the rhIL-1α with high-purity， high-expression and owing biological activity. The gene hIL-1α amplified by PCR was constructed into the eukaryotic expression vector pPICZαA/hIL-1α， and then it was transformed into the P. pastoris X-33 strain via electroporation.The engineering strain with high-expression of rhIL-1α was screened and assayed by the methods of PCR and SDSPAGE， further indentified by Western blot. The expressed product was purified by the DEAE Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography，and the bioactivity of it to human cancer Bel-7402 cell was initially assayed. Results showed that inducing rhIL-1α by methanol for 4 d at shaking flask level， the expression reached 30mg/L， the test by Western blot revealed that specific binding activity of rhIL-1α was detected；the purity of the rhIL-1α reached about 95% and the yield was about 40%；rhIL-1α inhibited the proliferation of Bel-7402 cells. In conclusion， recombinant engineering vector of rhIL-1α was successfully constructed， and it was highly expressed in P. pastoris， which lays groundwork for further study of its function and bioactivity.

recombinant human interleukin-1α；Pichia pastoris；expression；purification；Bel-7402 cell

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.035

2014-12-22

国家“973”前期研究专项（2012CB722304），河南省自然科学基金项目（142300413212，132300413208），河南省重大科技攻关项目（111100910600）

李斌，女，硕士，研究方向：微生物药物研究与开发，E-mail：libin8806@163.com

徐存拴，男，教授，研究方向：微生物药物研究与开发，E-mail：cellkeylab@126.com