嗜热链球菌的特性与应用研究进展

田辉 梁宏彰 霍贵成 Evivie Sm ith Etareri

（东北农业大学　乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨　150030）

嗜热链球菌的特性与应用研究进展

田辉 梁宏彰 霍贵成 Evivie Sm ith Etareri

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

嗜热链球菌是一种重要的工业用乳酸菌，广泛应用于发酵乳制品生产。近年来，对嗜热链球菌的研究已不仅仅停留于应用方面，而有关该菌基因组学等深层次特性机理的研究越来越多，对嗜热链球菌的研究和应用开发具有较好的参考价值。综述了嗜热链球菌的认定和应用、基因组学特征、发酵特性、噬菌体防御和共生机制等方面的研究进展，并展望了现代生物技术在嗜热链球菌特性研究中的应用前景。

嗜热链球菌；基因组；发酵；噬菌体；共生

嗜热链球菌是一种重要的工业用乳酸菌，可用于生产酸奶和奶酪等多种发酵乳制品。长期以来，人们对嗜热链球菌的研究和应用仅限于传统的菌株筛选和低效的反复试验之中，难以满足现代食品工业的需求。而随着人类基因组计划的实施和完成，基因组学和各种现代生物技术以崭新的面貌呈现，并以前所未有的速度解析多种生物规律和机理。截至2014年底，京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）共公布了3 511条全基因组序列，其中细菌3 036条，古细菌176条，真核生物299条［1］。

现代生物技术能够使人们将某一物种的基因组序列等静态数据，与在不同环境中的基因转录、翻译及蛋白质修饰等动态数据系统地结合，从整体上对物种的生长代谢性能进行分析和预测。近几年，人们应用基因组学、代谢组学、蛋白质组学和转录组学等方法深入研究了嗜热链球菌的特性，为嗜热链球菌在现代食品工业中的应用提供了丰富的依据。本文从嗜热链球菌的种属认定和应用、嗜热链球菌的基因组学特征和发酵特性、嗜热链球菌的防御体系、以及与保加利亚乳杆菌的共生机制等方面，依据现代生物技术的研究，对嗜热链球菌的特性和应用展开论述，为乳品微生物研究提供数据支持。

1 嗜热链球菌的认定与应用

乳酸菌是一类公认安全的食品级微生物，普遍存在于水果、蔬菜、谷物、酒、牛乳和人类胃肠道及泌尿生殖道等诸多环境中。乳酸菌能够代谢乳糖和葡萄糖等产生乳酸，被广泛应用于发酵乳制品、肉制品和青贮饲料等生产中。乳酸菌对人类健康具有重要作用，如人体肠道内的乳酸菌通过产生细菌素拮抗有害微生物。另外，乳酸菌发酵产生的短链脂肪酸和胞外多糖等代谢产物都是有益物质。乳酸菌是一类细菌的统称，所包含的种属涉及到乳球菌属（Lactococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、酒球菌属（Oenococcus）、片球菌属（Pediococcus）、链球菌属（Streptococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、和乳杆菌属（Lactobacillus）等［2］。

嗜热链球菌作为一种重要的工业用乳酸菌，广泛应用于发酵乳制品的生产之中，其重要性仅次于第一位的乳酸乳球菌，其每年的市场份额约为400亿美元［3］。鉴于嗜热链球菌在食品发酵中具有悠久历史，欧洲食品安全局（European food safety authority，EFSA）认定其具有安全资格（Qualified presumption of safety，QPS）［3，4］。作为最经典的酸奶发酵剂菌种，嗜热链球菌常与保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）一起用于酸奶生产，通过共生作用，二者相互促进，大大提高生长速度并改善酸奶品质［5］。嗜热链球菌是一种耐高温型乳酸菌，在酸奶和硬质奶酪生产中可耐受较高的发酵和加工温度［6］，与同为耐高温型乳酸菌的保加利亚乳杆菌或瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）一起用于生产，共同作用，快速产酸，赋予产品良好的质构特性和风味［7］。

人们对嗜热链球菌的分离与研究工作开始于上个世纪初。1991年，首次报道了嗜热链球菌的部分特性：革兰氏阳性、不运动、无芽孢、过氧化氢酶阴性、兼性厌氧、同型乳酸发酵、可生存于牛乳房黏膜和生牛乳中，而通过分析对比16S rRNA和超氧化物歧化酶sodA基因得知，与嗜热链球菌亲缘相近的是唾液链球菌和前庭链球菌，因此，嗜热链球菌曾一度被划为唾液链球菌的一个亚种，直到1991年通过DNA-DNA重组实验才将嗜热链球菌恢复到种的水平［6，8］。随后，嗜热链球菌被美国和欧盟确定为93个链球菌属中唯一的公认安全菌种［9］。现在，人们每年摄食的活体嗜热链球菌约1021个，在注重饮食营养与安全的现代生活中，由嗜热链球菌发酵生产的酸乳已成为一种遍布世界各地的产业化健康美食［6］。

发酵乳制品的产业化使得人们对发酵剂菌种（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和乳酸乳球菌）提出更严格的要求，如何开发利用嗜热链球菌，研制出满足要求的工业发酵剂，是嗜热链球菌研究的新内容。现代乳制品产业多采用的固定菌株，以及酸奶发酵剂的单一化，导致产品种类不足、生产过程易受噬菌体侵染等诸多缺点，因此分离和筛选新菌种作为发酵剂成为亟待解决的问题［10］；而另一方面，对候选菌种特性的了解程度，会直接影响到其产品质量的安全性与稳定性。所以，如何全面了解候选菌种的多方面特性是新菌株筛选所面临的一大难题。

2 嗜热链球菌的基因组学研究

2.1 嗜热链球菌的基因组特征

从2001年第一株乳酸菌（乳酸乳球菌IL1403）的全基因组测序完成，以后每年公布的乳酸菌全基因组序列的数量不断增加。2008年，Mayo等［11］报道乳酸菌的全基因组序列有属于15个种类的20多株被公布，其中包括嗜热链球菌CNRZ1066、LMG13811和LMD9。2011-2013年公布测序全基因组完成的嗜热链球菌有JIM8232、MN-ZLW-002、ND03和MTCC5461［12，13］。截至2014年底，在National Center for Biotechnology Information（NCBI） 网站能够查询到详细信息的嗜热链球菌有7株，分别是CNRZ 1066（基因组编号CP000024）、LMG 13811（基因组编号CP000023）、LMD-9（基因组编号CP000419）、MN-ZLW-002（基因组编号CP003499）、ND 03（基因组编号CP002340）、JIM 8232（基因组编号FR875178）及ASCC 1275（基因组编号CP006819），见表1［14］。通过统计分析表明：其基因组大小在1.85 Mb左右，含单一环状染色体，不含或含少量质粒，G+C含量低，约含有2 000个基因，不同嗜热链球菌的基因组在碱基水平上的相似度约95%［15］。嗜热链球菌与真核生物相比具有基因组小、不含内含子、富含多种营养物质运载体基因、代谢底物合成和分解基因以串联形式组成的操纵子等特点，为基因的高效转录、表达产物快速发挥作用奠定了基础，也为其组学研究创造了有利条件。

表1 七株嗜热链球菌的全基因组信息

2.2 嗜热链球菌的基因组进化

嗜热链球菌CNRZ 1066和LMG 13811分离自法国和英国传统酸奶，是首次完成全基因组测序的嗜热链球菌，其序列特征见表2。CNRZ 1066和LMG 13811菌株都含有一个约1.80 Mb的染色体，含约1 900个编码序列，其中近80%与链球菌属中其他菌种的序列同源，证实了嗜热链球菌在细菌分类中的重要地位。而两株菌（CNRZ 1066和LMG 13811）间也存在90%以上的同源序列，表明两者可能由共同的祖先菌株进化而来，根据两者基因组特征和自然突变速率估测，如果按照每天细胞裂殖1-10代计算，两株菌的共同祖先可追溯至107代之前，即3 000-30 000年前，与人们开始制作发酵乳制品的时间相吻合，说明此时人们已经开始使用嗜热链球菌了。Bolotin等［12］于2004年对这两株菌（CNRZ 1066和LMG 13811）的全基因组序列进行了比较发现，嗜热链球菌与链球菌属的其他菌种相比，基因组中明显发生了基因退化，其中10%的假基因多为糖代谢相关基因。因此，推测嗜热链球菌发生基因退化之前，其糖代谢基因可正常发挥作用，使菌株具有广泛的环境适应能力，其部分糖代谢基因失活是由于长期被人们应用于乳制品的发酵中，对糖类贫乏的乳环境（只含乳糖）的产生了适应；另一方面，嗜热链球菌基因组缺少存在于致命性链球菌中的诸多致病相关基因，如肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、生脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和引起龋齿的变形链球菌（Streptococcus mutans）［12，20］。因此，现代生物技术的组学在嗜热链球菌研究中的应用，明确了嗜热链球菌的进化进程，也证实了嗜热链球菌的安全性。

表2 嗜热链球菌CNRZ 1066和LMG 13811的基因组特征

2.3 基因的水平转移

不同菌株的基因组之间存在差异，可能是由基因丢失、基因重叠和基因的水平转移等引起的［2］。2011年，Delorme等［18］对一株分离自乳中的嗜热链球菌JIM 8232进行了基因组测定分析。由于能够产生黄色色素，因此该菌株具有较高的特异性。通过比较基因组学分析发现，JIM 8232基因组中存在一段长度为129 kb的特异性序列，这段序列可分为2.6-55 kb长度不等的9个区域，其中胞外多糖基因簇、限制/修饰系统和规律成簇的间隔短回文重复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）序列为该段的高变异区域，另外3个区域与抗氧化代谢相关，这6个区域的两侧都有基因座等移动元件；而最后3个区域为整合区域，包括剪接酶合成基因以及两个主要的基因岛（色素合成操纵子和prtS蛋白酶基因）。这些区域的特性说明它们是通过基因水平转移的方式整合到基因组上的，说明基因水平转移在嗜热链球菌基因组进化中起到了重要作用。

嗜热链球菌CNRZ 1066和LMG 13811是两株亲缘较近的菌株，然而它们在胞外多糖合成、限制/修饰系统、原噬菌体和CRISPR基因座等基因序列上存在差异［12］。2011年，在荷兰召开的第10届乳酸菌专题讨论会上，Goh等［9］介绍了将一株性能优良的嗜热链球菌LMD-9与两株菌CNRZ 1066和LMG 13811进行基因组比较分析，发现菌株LMD-9也拥有一段长度为114 kb的特异性序列，其中包括组氨酸合成、细胞表面蛋白酶、宿主防御机制和原噬菌体、假定粘液粘附蛋白、肽类运载体以及胞外多糖合成的相关基因，根据同源性分析表明这些特异性基因是菌株在特定乳环境中通过水平基因转移获得。事实上，嗜热链球菌的一些重要特性与基因水平转移是密不可分的，如胞外多糖的合成，细菌素的产生，限制性修饰系统及耐氧力等［2］。

3 嗜热链球菌发酵特性

牛乳富含多种营养物质，适合多种微生物生长和繁殖，而嗜热链球菌发酵牛乳时，具有快速生长产酸的特点，从而创造适合另一部分乳酸菌生长的酸性环境。嗜热链球菌能够在众多微生物中占据初期生长优势，主要在于其发酵过程中独特的糖代谢和蛋白质代谢能力，转录组学和蛋白质组学为人们对其发酵特性的研究提供了重要技术手段。

3.1 嗜热链球菌的基因表达特征

Derzelle等［21］在2005年首次测定了嗜热链球菌LMG 18311在牛乳和M17中生长的蛋白质组，分析了菌株在两种基质中的蛋白质表达差异，重点研究了与氨基酸摄入相关的酶，如肽酶PepX和一些氨基酸合成酶。研究发现菌株在两种基质中生长1.5 h后，主要蛋白表达差异是丙酮酸盐甲酸盐裂合酶（Pfl）、参与氨基酸与嘌呤合成的蛋白质，推测可能是由于乳中缺少必要的遗传物质，嗜热链球菌在乳中生长时Pfl高表达，因为它参与嘌呤的合成过程，而嘌呤是重要的遗传代谢物质。通过Northern blot对pfl基因的mRNA进一步研究发现，在乳中生长时，pfl基因表达上调，导致Pfl酶的含量增加，而向乳中添加甲酸和嘌呤碱基后，pfl基因的表达水平降低，Pfl酶的合成减弱，证明了Pfl酶在以甲酸盐为底物的合成反应中的重要作用，探索了Pfl酶的表达调控特性［21，22］。随后Salzano等［23］测定了嗜热链球菌ATCC 19258的细胞质蛋白和细胞膜蛋白，鉴定了对应于458个基因的蛋白质，包括参与碳源、脂肪酸、氨基酸和核酸代谢的酶类，基因复制、转录、翻译、细胞壁合成的蛋白酶类，以及与乳制品加工性能有关的重要蛋白质（如乳糖的摄入和胞外多糖的合成），实验结果有利于进一步分析和对比不同菌体的蛋白质组，为工业生产中优良菌株的筛选提供参照。Herve-Jimenez等［22］测定了关于LMG 18311在乳中生长的细胞质蛋白质组图谱，鉴定了203个不同的蛋白质，占理论蛋白质组的32%。通过转录组学和蛋白质组学方法分析了菌株在乳中不同生长阶段（2.5 h和5.5 h）的生理状况，确定了菌株生长后期上调表达的蛋白质分别为：（1）肽类与氨基酸的运载体，及特定氨基酸尤其是含硫氨基酸的合成；（2）糖类代谢中的相关蛋白质。新技术的应用使人们对嗜热链球菌在牛乳环境中生长的基因表达特征有了全局认识，为嗜热链球菌代谢特性的研究提供了更为深入的数据。

3.2 糖类代谢的研究

嗜热链球菌能够快速代谢牛乳中乳糖生成乳酸的能力，是其广泛应用于酸奶和奶酪生产的重要特性之一［21］。嗜热链球菌长期生长在牛乳环境中使其糖类代谢力退化，可利用的糖类较少，主要有乳糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖和果糖等，其中能够利用半乳糖和果糖的只占少数［6］。嗜热链球菌糖类代谢类型是同型乳酸发酵，代谢产物除L-乳酸外，尚有微量的甲酸盐、乙偶姻（3-羟基-2-丁酮）、丁二酮、乙醛和醋酸盐等［6］及与发酵乳风味形成的相关物质。

3.2.1 乳糖代谢系统 牛乳中的糖种类单一，但其中的乳糖含量相对比较丰富，长期的进化使嗜热链球菌对乳糖具有较强的偏好性［24］。当分别以3种糖（乳糖、蔗糖和葡萄糖）为单一碳源时，嗜热链球菌A147在葡萄糖基质中生长时会出现迟滞期延长、生长速率为缓慢的现象。以蔗糖和果糖为代谢底物时，其糖转运系统中可以检测到磷酸烯醇式丙酮酸依赖型磷酸转移酶系统（PTS）代谢活力。而以葡萄糖、乳糖和半乳糖为底物时则没有出现该现象，进一步研究表明，乳糖和半乳糖的转运是通过乳糖渗透酶（LacS）二级转运蛋白进行的，该菌的糖转运特征如表3所示［24］。对于大部分乳酸菌，葡萄糖是典型的PTS碳源，能够被迅速摄取并利用，而对于嗜热链球菌，葡萄糖却是一种非PTS碳源，并且其利用率显著低于另一种非PTS糖类——乳糖［25］。Bolotin等［12］在菌株CNRZ 1066和LMG 13811的基因组中发现，有7个基因座编码PTS系统（ptsG、fruA、bglP、treP、manLMN、celB和scrA）、2个基因座编码糖类ABC转运体（malEF，stu/str0808-811）、2个编码糖类转运体lacS和stu/str0855，但是这些基因中含有大量的假基因以及无编码功能基因，说明嗜热链球菌产生了基因丢失性进化［6］，因此，结合嗜热链球菌A147糖转运系统的研究可知，引起上述差异的主要原因在于嗜热链球菌在进化过程中丢失了葡萄糖PST转运系统相关基因，大大降低了葡萄糖摄取能力，而乳糖的代谢基因却得到保留，包括乳糖渗透酶（LacS）和β-半乳糖苷酶（LacZ），其中LacS是一种转运乳糖的非磷酸系统转移酶［21，25］，而β-半乳糖苷酶是乳糖/半乳糖的反向运载体［6］。乳糖进入菌体后被β-半乳糖苷酶分解为半乳糖和葡萄糖，其中的葡萄糖可被嗜热链球菌株利用，而半乳糖一般情况下不被利用，经LacZ排出体外。

表3 嗜热链球菌A147的糖类转运机制

嗜热链球菌不能代谢半乳糖的特性也从基因水平上得到了解释。嗜热链球菌中多数是不能利用半乳糖的，然而van den Bogaard等［26］发现在半乳糖代谢阴性菌株中也存在编码半乳糖代谢（Leloir途径）的基因（galK-TEM），与阳性突变菌株的基因进行比较发现，限制大多数嗜热链球菌半乳糖代谢的主要原因并非是缺少相关的代谢基因，而是其表达的半乳糖激酶活力较低所致［27，28］（图1）。该发现揭示了嗜热链球菌糖代谢的重要机理，改变了以往人们的观点，为以后的代谢调控提供了数据参考，指明了正确的研究途径。

3.2.2 糖代谢调控因子 嗜热链球菌的乳糖代谢基因簇是高度保守的，包括半乳糖代谢（Leloir途径）基因和乳糖代谢（转运和分解）基因，这些基因连接在一起组成一个基因簇，即galKTEMlacSZ。在galK基因上游有一个转录调控子编码基因galR，它能对两个操纵子（galKTEM和lacSZ）的转录进行正调控［27］。半乳糖代谢阳性菌株CNRZ 302能够较高水平地表达galKTE，经过分析表明，其galK启动子区域出现了特定变异［27］。两个操纵子除了受galR的正调控外，其中lac S启动子还受分解代谢控制蛋白CcpA的调控。CcpA通过lac S启动子区的cre（CcpA感应因子）而产生作用，抑制lacSZ表达，减少乳糖的摄入，同时又能提高糖酵解过程中3种关键酶（乳酸脱氢酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶）的表达，加速胞内糖的酵解。CcpA突变菌株的乳糖摄入和分解能力大大增加，但却将大量半乳糖和葡萄糖排出胞外，从而导致乳酸生成速率和菌株生长速率大大降低，这说明CcpA对lacS启动子的调控能力可以使乳糖摄入和分解过程与整个糖酵解过程达到更好的平衡［25］。通过DNA微阵列实验对比嗜热链球菌野生菌株和CcpA突变菌株发现，CcpA的突变影响了大量的转录调控子，其中包括金属离子转运系统的一些调控子，说明CcpA不仅能调控糖代谢，还参与其他代谢途径［6］。

图1 嗜热链球菌gal-lac基因簇［26］

3.2.3 胞外多糖合成 胞外多糖能够改善发酵乳制品组织和流变特性，防止脱水收缩，产生丝滑柔顺的组织特性，赋予产品良好的口感和味觉［6］。多种细菌具有产生胞外多糖的能力，如果胞外多糖结合于细胞表面称为荚膜多糖（Capsular polysaccharides，CPS），如果脱离细胞而释放到培养基中则称为胞外多糖（Extracellular polysaccharide，EPS）。胞外多糖又可根据其组成单元是一种单糖还是不同单糖而分为同型多聚糖和杂型多聚糖。首次被测定结构的EPS产自菌株CNCMI 733、734和735，它们产生的胞外多糖中D-半乳糖∶D-葡萄糖∶2-乙酰-氨基-2-脱氧-D-半乳糖的比例为2∶1∶1［29］，大多数嗜热链球菌产生杂多聚糖的胞外多糖，也有一些菌株产生的是荚膜多糖［6，30］。嗜热链球菌的EPS结构多样，组成单元主要由半乳糖、葡萄糖和鼠李糖组成，但也有N-乙酰基-半乳糖胺、果糖和乙酰基半乳糖［30］。嗜热链球菌产生胞外多糖的特性具有菌株特异性，与生长速率相关，而且其合成与分子结构明显受生长条件，如温度、pH、碳源种类、浓度及C/N比等影响［31］。

目前有至少12个不同的eps基因簇序列被测定和公布，但通过限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析，却发现有60多个不同的eps基因簇存在［32］。Eps基因簇主要包括调控基因（epsA、epsB）、糖链长度控制基因（epsC、epsD）、重复性片段单元的合成基因（epsE、epsF、epsG、epsH和epsI）、单元聚合及多糖释放控制基因（epsK、epsL和epsM）［30，31］。嗜热链球菌胞外多糖合成途径相对保守，并与同属中其他链球菌相似［31］，由葡萄糖-6-磷酸开始，生成葡萄糖-1-磷酸，经UDP-葡萄糖焦磷酸化酶形成UDP-葡萄糖参与合成EPS［6］。Rasmussen等［7］基于已公布的2 200个基因设计了DNA微阵列，分析了47株链球菌的基因组，发现几乎所有菌株都含有deoD-epsABCD基因，7株菌没有epsE（编码半乳糖-1磷酸或葡萄糖-1-磷酸转移酶），2个菌株不含epsA（编码转录调控子），但在其他胞外多糖合成基因和整个基因簇组织上存在多种形式，证明eps基因簇结构的高度可变性。比较CNRZ 1066、LMG 18311和LMD-9三株嗜热链球菌的全基因组发现，嗜热链球菌LMD-9有两个eps基因簇，分别为eps基因簇和rgp基因簇，3株嗜热链球菌和一株唾液链球菌（SK126）的eps基因序列相似度在90%以上，尤其是在5'和3'两端的区域，而且两端的保守区域分别与deoD（编码嘌呤核苷磷酸酶）和bglH（编码β-糖苷酶）毗邻［9］。嗜热链球菌eps基因簇中一些移动元件也发现于其他链球菌和乳酸乳球菌，说明了eps基因簇的可移动性。嗜热链球菌CNRZ 1066和Sfi6基因组中的eps基因簇的同源［32］，也说明了这个问题。eps基因簇的高变异性可能由于其在水平基因转移或基因重组过程中插入片段或丢失片段等原因［30］。大量关于嗜热链球菌全基因组的分析都证明eps基因簇与基因水平转移相关，如JIM 8232［18］，以及在ND03基因组中发现eps基因簇存在多拷贝的IS元件，而这些元件也导致菌株eps基因具有较高特异性［17］。

许多乳酸菌产EPS的性状是不稳定的，甚至可能会永久性丢失。在乳酸乳球菌中，由于多糖控制基因存在于质粒上，因此可以用质粒的不稳定来解释EPS的性状丢失，但嗜热链球菌的eps合成基因全部存于染色体上，其性状不稳定可能是一些插入元件插入在eps基因簇的内部或者与其相连所致，也可能是由于整体基因组不稳定性导致EPS的产生具有可变性［30］。而从另外一个角度来看，其可变性又为阴性嗜热链球菌获得产EPS的特性提供了机会。

3.3 蛋白质代谢的研究

3.3.1 关键代谢基因prtS 乳中氨基酸和短肽含量虽然相对较少，但却富含大量蛋白质，主要包括酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白通过钙离子交联以胶束形式存在，因此不能直接被乳酸菌摄入，所以嗜热链球菌通过多种蛋白酶及氨基酸肽类转运系统将乳中酪蛋白水解为二肽、三肽及多肽，摄入至胞内参与氨基酸和蛋白质的合成、降解等代谢［22］。与乳酸乳球菌蛋白质水解系统相比，嗜热链球菌对外源氨基酸的摄入能力较弱［21］。乳酸乳球菌主要依靠细胞壁蛋白酶（PrtP）分解乳中酪蛋白为自身提供所需求的氨基酸，而嗜热链球菌中仅有少数菌株具有细胞外蛋白酶（PrtS）。PrtS是枯草杆菌蛋白酶家族的一种丝氨酸蛋白酶，能分解乳蛋白，提供肽类和氨基酸，使嗜热链球菌在乳中快速生长，当菌株含有该酶时，菌体密度能够迅速达到109CFU/mL，而不含该酶的菌株最多只能达到108CFU/mL［22，33］。在发酵乳制品生产和优良发酵剂的评估中，嗜热链球菌的生长速率可由产酸速率来体现，产酸速率越高代表发酵剂的生长性能越好。因此，PrtS蛋白酶的存在与否将决定嗜热链球菌是快产酸型菌株或是慢产酸型菌株，尤其当嗜热链球菌以单菌株作为发酵剂时，PrtS更能起到关键作用。嗜热链球菌作为生长起始菌株，能快速生长产酸，使pH值迅速降低，因此常选用产酸性能较强的嗜热链球菌作为工业生产用菌株［10］。而在INRA所收集的135株菌中，仅有21株为细胞壁蛋白酶阳性菌株，表明了prtS基因在嗜热链球菌中的稀有性。嗜热链球菌中prtS是一个长为15 kb的基因，存在于菌株LMD 9，而不存在于菌株LMG 18311和CNRZ 1066［6，33］，可能通过水平基因转移获得。Dandoy等［33］将PrtS阳性菌株的prtS基因转化到3株产酸较慢的PrtS阴性菌株（LMG 18311、DGCC 7666和DGCC 7891）中，使重组菌株产酸速率提高2.4倍，迟滞期缩短，产酸至pH 5.2的时间缩短2-3倍。该实验的成功为乳品发酵剂定向改造提供了新思路，即可以将不同的乳品工业相关特征（快速产酸、组织结构的影响、细菌素的产生、抗噬菌体等）组合到单株菌中，使人们在生产中利用单菌株即可达到产品要求，既简化了生产步骤，又节约了成本投入。

3.3.2 氨基酸合成特性 由上可知，大部分嗜热链球菌不能水解酪蛋白，而依靠自身氨基酸合成和细胞内肽酶的作用来满足自身氨基酸需求主要。氨基酸的合成对嗜热链球菌的生长具有关键作用，尤其是支链氨基酸的合成，是其在天然牛乳环境中生长的关键途径之一［22］。虽然一些菌株能够满足自身的氨基酸需要，但是也有一部分菌株不能合成特定的氨基酸。对菌株LMD 9与LMG 18311和CNRZ 1066的基因组比较分析发现，其基因组缺少谷氨酸合成基因，这一结果解释了该菌株不能在谷氨酸和谷氨酰胺都缺少的环境中生长的现象［6］。尽管氨基酸合成对嗜热链球菌具有重要作用，在基因组序列中氨基酸合成的基因序列也是高度保守的，但其中也含有一定数量的假基因，如在菌株LMG 18311中，假基因包括参与合成丙氨酸、赖氨酸、支链氨基酸和含硫氨基酸的alaD、dapE、ilvD和yhcE基因，另外菌株CNRZ 1066中的天冬氨酸氨基转移酶aspC3也是假基因［6］。生物信息学预测嗜热链球菌LMG 18311和CNRZ 1066具有合成除了组氨酸外的其他氨基酸的所有基因，但是经过实验验证的只有参与支链氨基酸和脯氨酸合成的基因。由于大部分嗜热链球菌都能在混合有谷氨酰胺、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和组氨酸的底物中生长，因此推测其他氨基酸可以由菌株自身合成［6］。更多关于CNRZ 1066和LMG 13811的基因组序列的分析研究表明，嗜热链球菌有20多种潜在的胞内肽酶［12］。其中一些肽酶的基因序列已被克隆并研究，包括两个氨肽酶基因（pepN和pepC）、一个内肽酶基因（pepO）、一个X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶基因（pepX）和一个氨肽酶（pepS）［34］。一株营养缺陷嗜热链球菌中，由于肽的转运、支链氨基酸和嘌呤的合成基因失活，使得该菌株不能在乳中生长，因此，嗜热链球菌的正常生长需要具有自身转运肽类并转化为氨基酸或合成氨基酸的能力［21］。

3.3.3 氮代谢调控因子 菌株LMG 18311和CNRZ 1066的基因组中发现了乳酸乳球菌中调控基因的同系物，如CodY（Stu1635）、ArgR（Stu0048）、GlnR（Stu0177）、AhrC（Stu1214）以及FhuR（Stu0520、Stu0452和Stu0872）。CodY蛋白是存在于革兰氏阳性细菌中的一种上游转录调控因子，它能调控蛋白水解系统中相关基因的表达，当细胞内支链氨基酸（异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸）的浓度增大时，CodY 能够结合到蛋白水解系统相应基因操纵子的上游序列，从而阻止这些基因的表达。在营养物质缺乏时支链氨基酸浓度降低，菌株生长进入稳定期，此时蛋白水解系统的基因被诱导表达，帮助菌体适应营养僵乏的环境。本实验室根据已公布的嗜热链球菌CNRZ1066和LMD-9的基因组信息，推断嗜热链球菌中也应含有一个类似的调控蛋白CodY，并根据嗜热链球菌基因组序列设计了引物Co1和Co2，分别对5株嗜热链球菌的CodY基因进行PCR扩增，证实了codY基因的存在，嗜热链球菌的codY基因序列具有非常保守的特点。实验进一步证实了CodY蛋白在嗜热链球菌蛋白代谢中的调控作用，为高效酸奶发酵剂的开发提供了理论依据［35］。

4 嗜热链球的防御体系

生产环境较为安全、杂菌污染较少的乳制品生产发酵过程中，嗜热链球菌遭受噬菌体污染也成为了一个难以避免的难题。

嗜热链球菌对于噬菌体存在一定的防御机制。其中成簇的短间隔回文重复序列以及其相关核酸内切酶系统（CRISPR-Cas），是人们研究最多的噬菌体防御系统。该系统的Cas（CRISPR-associated）核酸内切酶通过CRISPR序列相关RNA（crRNA）的定向诱导对外源DNA片段进行特异性切割，达到使噬菌体侵染流产的目的。另外，切割后产生的外源DNA碎片会整合到CRISPR序列中，加强crRNA的定向诱导作用。因此，该系统是一个天然的分子免疫系统。

通过比较分析发现，嗜热链球菌中存在多种类型的CRISPR-Cas系统，而且几乎都含有1-4个不同的CRISPR序列。本实验室邓凯波等［36］研究实验室菌种库中8株嗜热链球菌的CRISPR序列，分别检测了菌株中的CRISPR序列的存在，并分析了序列同源性，结果表明除1株菌含有1个CRISPR结构外，其余7株菌均含有3个结构，序列长度最长为2 853 bp，最短仅为101 bp。通过同源性比对发现，CRISPR序列中的重复序列与远缘菌种具有较高同源性，表明CRISPR序列可能通过水平基因转移获得。该研究对我国野生嗜热链球菌抗噬菌体性能的研究提供参考，有利于高品质自主发酵剂研究的进展。

5 与保加利亚乳杆菌的共生作用机制

嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在发酵牛乳的过程中，能够相互提供营养物质和生长因子，使生长和产酸速度得到很大提升，被称为共生作用。这种共生作用体现在多方面，其中最为明显的是保加利亚乳杆菌利用细胞壁蛋白酶水解乳蛋白，产生肽类和游离氨基酸，为蛋白水解力相对较差的嗜热链球菌提供氮源需求［21］；同时嗜热链球菌为保加利亚乳杆菌提供叶酸、甲酸和CO2，作为合成嘌呤的前体或辅助因子，促进保加利亚乳杆菌快速生长［37，38］。

Herve-Jimenez等［22］在嗜热链球菌LMG 18311与保加利亚乳杆菌共同培养，研究对嗜热链球菌表达特性的影响，结果表明嗜热链球菌生长后期的糖代谢基因、肽类和氨基酸运载体基因上调表达未受影响，说明保加利亚乳杆菌了对嗜热链球菌生长的无抑制作用。刘梦晋等（Liu）［39］通过计算机模拟技术分析嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的全基因组序列，预测了两者之间的水平基因转移，结果表明，在酸奶生产历史中，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌由于长期在同一环境中共存，导致两者之间更容易发生水平基因转移，使菌株在基因水平上产生优化，有利于更好地相互作用和生长，其中EPS合成基因从嗜热链球菌转移到保加利亚乳杆菌，而含硫氨基酸代谢的cbs-cblB（cglB）-cysE基因簇（或称为cysM2-metB2-cysE2）则从保加利亚乳杆菌转移到嗜热链球菌。

Herve-Jimenez等［40］及Sieuwerts等［38］通过转录组学和蛋白质组学研究发现，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的相互作用涉及到嘌呤、含硫氨基酸和短链脂肪酸的代谢，通过计算机模拟技术、转录组学和功能基因组学方法分析嗜热链球菌LMD-9双组份系统，测定出6个具有HK和RR的完整TCS（TCS 2、4、5、6、7和9），以及两个不完整的HK系统（RR01和08）。在对数生长期时（pH 5.5）的嗜热链球菌添加保加利亚乳杆菌，并以单菌株嗜热链球菌作对照发现，由于保加利亚乳杆菌的加入，嗜热链球菌的4个RR表达上调，导致嗜热链球菌的调控产生变化［41］，表明在酸奶生产中，嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的共生作用，就是通过双组份系统感应并调控自身代谢。

Sieuwerts等［38］通过转录组学对两株菌（CNRZ 1066、ATCC BAA-365）进行深层次研究发现，共生过程中保加利亚乳杆菌只存在一个对数生长期，而嗜热链球菌则出现了不同的生长曲线，分别为延迟期、第一个对数期、过渡期、第二个对数期和稳定期4个生长步骤；实验还发现，在共同培养过程中，支链氨基酸和含硫氨基酸合成基因发生上调，说明两种菌株难以得到足够的此类氨基酸，两个菌种虽然相互提供一定的营养物质，但是由于酪蛋白中仅能释放出较低含量的支链氨基酸（6%-7%）、精氨酸（4%）和半胱氨酸残基（0.35），所以只依靠杆菌的蛋白质水解作用不能为两个菌种提供足够的含硫氨基酸和支链氨基酸。共生过程中上调表达的还有eps基因，EPS主要在嗜热链球菌的发酵后期产生，可能是培养基低pH值诱导产生EPS，基因epsA-M在第二个对数期及稳定期时才产生高表达，且EPS产量也相应增加。

6 展望

现代生物技术的应用使嗜热链球菌的遗传和生长代谢特性研究得到了丰硕成果，为嗜热链球菌发酵开发过程中的关键基因和代谢途径的发掘提供了大量信息。在不断发展更新的生物技术的促进下，以基因组学为核心，与转录组学、蛋白质组学与代谢组学等共同组成了能够全面理解生物本质和特性的系统生物学。而系统生物学将依靠互联网技术，逐渐地整合生物学理论、数学模型和应用计算机等，形成生物信息学和系统生物学的整体分析模式，为嗜热链球菌的研究引入新的阶段。不久的将来，围绕嗜热链球菌如何提高产胞外多糖、风味、共生机制、抗噬菌体等性能，利用最新的生物技术和多学科交叉，会出现越来越多的高新成果，为发酵乳制品的发展注入新活力。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Progress on the Property and App lication of Streptococcus thermophilus

Tian Hui Liang Hongzhang Huo Guicheng Evivie Smich Ecareri
（Key Lab of Dairy Science of Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin150030）

Streptococcus thermophilus is one of the most important species of lactic acid bacteria in industry， and it is widely used in the process of producing fermented milk. This review discusses researches on the qualification and application of S. thermophilus， the properties of genome and fermentation， phage defense system， and symbiotic mechanism. In the end， the potential application of modern biological technologies in the study of S. thermophilus properties is prospected.

Streptococcus thermophilus；property；genome；fermentaion；phage；protocooperation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.006

2014-11-14

国家“863”计划项目（2011AA100902，2012AA022108）

田辉，男，博士研究生，研究方向：乳品科学与工程；E-mail：qingdaoyun08@163.com

霍贵成，男，教授，博士生导师，研究方向：食品科学；E-mail：gchuo58@126.com