酶解法提取银耳多糖的工艺及稳定性研究

鲍会梅

（江苏食品药品职业技术学院食品与营养工程学院，江苏淮安223003）

酶解法提取银耳多糖的工艺及稳定性研究

鲍会梅

（江苏食品药品职业技术学院食品与营养工程学院，江苏淮安223003）

为了对银耳多糖进行深加工，本文优化了酶解法提取银耳多糖的提取条件。酶解法最高提取率为15.36%，回收率97.3%，精密度1.2%，最佳条件为：纤维素酶1.5%，纤维素酶0.5%，中性蛋白酶2.0%，温度50℃，pH4.5，时间60 min。通过试验证明温度、pH对多糖提取液影响极小，提取液具有良好的稳定性。白砂糖对提取液有促进作用，乳酸反之。酶解法是一种条件温和、节约能耗、提取率高的提取方法。

银耳；多糖；提取；影响因素

银耳多糖是银耳中的功能性成分，具有活性作用，无甜味，易溶于热水［1］，且水溶液有旋光性，无变旋现象。银耳多糖具有多种功能，如提高机体免疫力，抗肿瘤作用，降血糖、降血脂、降血压作用，抗疲劳、抗衰老作用，抗病毒作用，抗氧化作用等。

近10多年来，许多学者围绕食用菌的营养成分、功能因子、保健功效等方面进行了研究［2］。对于银耳的种植、提取、纯化等发面已有了部分研究，但银耳功能成分多糖并未得到广泛深入的研究，其利用开发也是少之又少。银耳多糖拥有广阔的市场，不仅具有较高的营养价值，而且还具有一定的医疗保健功能和巨大的药用价值，其功能特性越来越受到关注，故而我们很有必要加大对银耳多糖的开发利用，实现其商品价值［3］。

本文对水提法、碱提法、酶解法3种提取多糖的方法进行比较，得出最佳提取方法是酶解法，并对影响酶解法提取多糖的影响因素进行探讨，得到提取的最佳条件。通过试验分析温度、pH对多糖提取液的稳定性影响，再分析不同添加量的白砂糖、乳酸对提取液黏度的影响。

1材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1原料

银耳：购于淮安市苏果超市。

1.1.2试剂

果胶酶；纤维素酶；中性蛋白酶；三氯乙酸；氢氧化钠溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；白砂糖；乳酸；柠檬酸等。以上试剂购自于南京化学试剂股份有限公司，均为分析纯。

1.1.3仪器

IFM-100高速粉碎机：上海蒙特工业自动化有限公司；R-201真空旋转蒸发仪：北京中西泰安技术服务有限公司；UV2100型紫外可见分光光度计：上海仪托环保仪器有限公司；NDZ-79旋转式黏度计：上海方瑞仪器有限公司；BSZ100自动部分收集器：苏州江东精密仪器有限公司；雷磁PHS-3C精密pH计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1热水提取法

银耳磨碎成粉按体积比1∶60加水，置于80℃水浴中恒温提取4h，过滤，滤渣用相同方法水提2次，合并水提液。浓缩，加三氯乙酸除蛋白。离心，取上清液，定容。

1.2.2碱提取法

银耳磨碎成粉按体积比1∶100加入1 mol/L氢氧化钠溶液，置于80℃水浴中提取4 h，过滤，稀碱提取液经中和、浓缩后，加三氯乙酸除蛋白，浓缩、定容。

1.2.3酶解提取法

银耳磨碎成粉按体积比1∶80加水，调至pH6.6，加入1.5%的复合酶（中性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），置于40℃水浴中恒温酶促反应4 h，迅速升温至80℃灭酶，恒温提取1 h，过滤，滤液浓缩后加入3倍体积95%乙醇静置过夜。离心，弃上清液，沉淀加水溶解，三氯乙酸除蛋白，定容［4］。

通过对热水提取法、碱提取法和酶碱提取法的比较，得出酶解提取法的提取效果最好，故而下面对酶解提取法的提取条件进行探讨。

1.2.4酶添加量对多糖提取率的影响

精密称取银耳粉2.0 g（6份），加入pH5.0的磷酸盐缓冲液各20 mL，分别加入0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1%的复合酶（中性蛋白酶、果胶酶和纤维素酶），在50℃下水浴70 min［5］，以多糖提取率为指标，确定复合酶的最佳用量。

1.2.5pH对多糖提取率的影响

精密称取银耳粉2.0 g（6份），分别加入pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的磷酸盐缓冲液20 mL，并加入1.2.4中最佳用量的复合酶，在50℃下水浴70 min［5］，以多糖提取率为指标，确定多糖提取的最佳pH。

1.2.6温度对多糖提取率的影响

精密称取银耳粉2.0 g（5份），加入1.2.5中最佳pH的磷酸和磷酸钠缓冲液各20 mL，并加入1.2.4中最佳用量的复合酶，分别在10、30、50、70、90℃下水浴70 min［6］，以多糖提取率为指标，确定多糖提取的最佳温度。

1.2.7提取时间对多糖提取率的影响

精密称取银耳粉2.0 g（5份），加入pH5.0的柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液各20 mL，并加入1.2.4中最佳用量的复合酶，分别在2.2.6中的最佳温度下分别水浴20、40、60、80、100 min，以多糖提取率为指标，确定多糖提取的最佳时间［7］。

1.2.8复合酶配比的正交实验设计

以上述影响3种酶的最佳温度、最佳pH和最佳提取时间，以不同质量百分比的纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶的不同酶用量设计正交实验，确定复合酶的最佳配比。实验因素水平设计如表1所示。

表1　复合酶配比正交实验因素水平表Table 1The ratio of compound enzymes orthogonal experiment factor level table

1.2.9复合酶提取工艺正交实验设计

按照最佳复合酶配比的实验结果，加入最佳配比的纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶，以提取温度、提取时pH和提取时间为因素，进行正交实验。实验因素水平设计如表2所示。

表2　复合酶提取因素正交实验因素水平表Table 2Compound enzyme extraction orthogonal experiment factors and levels of factors

1.2.10多糖提取液的稳定性实验

将上述酶解提取法中的银耳多糖提取液经过精滤、浓缩、防腐制成银耳多糖提取液成品，再讨论温度和pH对多糖提取液的影响。

温度对多糖提取液稳定性的影响：分别将银耳多糖提取液放置于5℃条件下2个月，25℃条件下2个月，39℃条件下2个月，5℃和39℃每24小时交替一次（持续2个月），放置结束后恢复到温度20℃时检测银耳多糖提取液的多糖质量浓度、pH、吸光度（波长400 nm）和黏度等理化指标［8］，判断其在不同温度下的热稳定性，从而证明多糖产品能够长期储存。

pH对多糖提取液稳定性的影响：室温下，通过加入柠檬酸溶液或NaOH溶液将银耳多糖提取液的pH调节至4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5分别检测在各个pH条件下银耳多糖提取液的多糖质量浓度、吸光度（波长400 nm）和黏度等理化指标［9］，从而判断其酸碱稳定性。

1.2.11添加剂对银耳提取液黏度的影响

在银耳多糖产品生产过程中，由于会添加白砂糖、乳酸，其加入可能会改变银耳提取液的黏度，从而影响银耳多糖产品的质量。因此，将白砂糖、乳酸对银耳提取液的黏度影响进行了试验［10］。

白砂糖添加量对多糖提取液黏度的影响：取5份1.2.10所述的银耳多糖提取液成品，分别加入5、10、15、20、25 g白砂糖。样品经搅拌静置后，在30℃下进行测定，以银耳多糖提取液的黏度作为指标，从而判断白砂糖对银耳多糖提取液有何影响，同时进行空白试验。

乳酸添加量对多糖提取液黏度的影响：取5份1.2.10所述的银耳多糖提取液成品，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL乳酸。样品经搅拌静置后进行测定，以银耳多糖提取液的黏度作为指标，从而判断乳酸对银耳多糖提取液有何影响，同时进行空白试验。

2结果与分析

2.1水、碱、酶法提取多糖的比较

用热水提取法、碱提取法、酶解提取法提取银耳多糖，根据多糖的提取率、回收率、误差绝对值、精密度，将三者进行比较，结果见表3，并选出最优方法。

表3　3种提取多糖方法的比较Table 3Comparison of three kinds of polysaccharides extraction method %

由表3可以看出，酶解法的提取率、回收率、精密度均高于水提法和碱提法，酶解法的误差绝对值也略低于水提法和碱提法，即酶解法为最佳提取方法。国标中回收率的范围为87.8%～110.8%，精密度小于5.8%，酶解法符合国标标准，所以此方法可行。

另外，水提取的缺点是提取温度高，耗时长且效率低，成本高，安全性低，而碱提取易破坏多糖的空间结构及活性。酶解法具有条件温和、易去除杂质和节约能耗等优点。

2.2酶添加量对多糖提取率的影响

由上述1.2.4的操作步骤进行实验，实验结果如图1所示。

由图1可知，随着酶添加量的增加，多糖的提取率逐渐增加，当酶添加量为1.8%时，多糖的提取率达到最高，提取率为15.15%。

2.3pH对多糖提取率的影响

由上述1.2.5所述步骤进行实验，实验结果如图2所示。

图1　酶添加量对多糖提取率的影响Fig.1Effect of enzyme addition quantity on the rate of extraction of polysaccharide

图2　pH对多糖提取率的影响Fig.2Effect of pH on the rate of extraction of polysaccharide

由图2可知，随着pH得升高，多糖的提取率也升高，在pH为4.5时提取率略有下降趋势，pH为4.5时，多糖提取率最高，提取率为15.13%。

2.4温度对多糖提取率的影响

由上述1.2.6的操作步骤进行实验，实验结果如图3所示。

图3　温度对多糖提取率的影响Fig.3Effect of temperature on the rate of extraction of polysaccharide

由图3可知，温度对多糖提取率的影响呈抛物线形，温度对多糖提取率的影响较大，当温度达50℃时提取率最高，提取率为15.16%。

2.5提取时间对多糖提取率的影响

由上述1.2.7的操作步骤进行实验，实验结果如图4所示。

由图4可知，在提取时间大于40 min后，时间对多糖提取率影响呈直线趋势，提取时间对多糖提取率的影响不大，当提取时间为60 min时，提取率达到最高，提取率为14.98%。

2.6酶法提取多糖的正交试验

图4　提取时间对多糖提取率的影响Fig.4Effects of extraction time on yield of polysaccharide extraction

根据单因素对多糖得率的影响，考虑到不同因素和酶共同作用会影响多糖提取率，因此设计正交实验，确定复合酶的最佳配比和最佳反应条件。

2.6.1复合酶酶量配比正交试验

采用三因素三水平的正交试验确定复合酶最佳配比，分9组实验，分别选择不同质量百分比的纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的酶用量进行正交试验，结果见表4。

表4　复合酶配比正交试验结果分析Table 4Analysis of orthogonal experimental results of composite enzyme

如表4所示，从极差分析结果来看，影响酶解提取法的各个因素的优先顺序为C＞A＞B，最佳条件应为A2B1C3，即纤维素酶添加量为1.5%，果胶酶添加量为0.5%，中性蛋白酶添加量为2.0%，银耳多糖的提取率为15.17%。

2.6.2复合酶提取工艺正交试验

确定了复合酶的最佳配比，再考虑提取温度、提取pH值和提取时间对银耳多糖提取率的影响，针对这些因素，采用三因素三水平的正交试验确定反应的最佳条件。分9组实验，加入最佳配比的复合酶，分别在不同的温度、pH、时间条件下进行正交试验，结果见表5。

表5　复合酶提取工艺正交实验结果分析Table 5Results of orthogonal experiment of compound enzyme extraction process analysis

如表5所示，从极差分析结果来看，影响酶解提取法的各个因素的优先顺序为A＞B＞C，最佳条件应为A2B2C2，即提取温度为50℃，pH为4.5，提取时间为60 min，银耳多糖的提取率为15.36%。

2.7多糖提取液的稳定性实验

2.7.1温度对提取液稳定性的影响

对上所述的银耳多糖的提取液进行热稳定性测试，调至不同温度，测试其中pH、多糖质量浓度、吸光度（波长400 nm）和黏度，结果如表6所示。

表6　温度对提取液稳定性的影响Table 6Effect of temperature on the stability of the extract

从表6可以看出，温度对银耳多糖提取液的pH值、多糖质量浓度、吸光度和黏度影响都比较小。综合测试的各项指标可知，银耳多糖提取液在很大的温度范围内都是稳定的，所以银耳多糖产品可以长时间储存而不变质。

2.7.2pH对提取液稳定性的影响

对上所述的银耳多糖提取液进行酸碱稳定性测试，调至不同pH，测试其中多糖质量浓度、吸光度（波长400 nm）、流动性和黏度，结果如表7所示。

表7　pH对多糖提取液稳定性的影响Table 7Effect of pH on the stability of the solution of polysaccharide extraction

从表7可以看出，在pH范围为4.5～10.5时，银耳多糖提取液的多糖质量浓度和流动性都未受到pH变化的影响，吸光度和黏度变化也比较小，所以综合测试的各项指标可证明，银耳多糖的提取液在pH为4.5～10.5范围内具有良好的酸碱稳定性，可以应用于各类pH范围的产品中，应用范围较为广泛。

2.8添加剂对多糖提取液黏度的影响

2.8.1白砂糖添加量对多糖提取液黏度的影响

向银耳多糖提取液加入不同量的白砂糖，测定其对提取液黏度的影响，结果如表8所示。

表8　白砂糖增加量对提取液黏度的影响Table 8Effect of sugar increase to extract viscosity

从表8可以看出，随着白砂糖添加量的增加，提取液黏度呈上升趋势，说明白砂糖并不会对其产生不利影响，反而起到了促进作用。在银耳的多糖产品中可根据产品的口感要求添加适量的白砂糖。

2.8.2乳酸添加量对多糖提取液黏度的影响

向银耳多糖提取液加入不同量的乳酸，测定其对提取液黏度的影响，结果如表9所示。

表9　乳酸增加量对黏度的影响Table 9Effect of lactic acid on the viscosity increase

从表9可以看出，随着乳酸添加量的增加，多糖提取液黏度呈下降趋势，对其造成不利影响。所以在银耳的多糖产品加工过程中，为保证乳酸的添加不影响产品的质量，乳酸的添加量偏小比较好。

3结论

银耳多糖的3种提取方法中，热水提取法提取率最低，碱提取法提取法提取率较高，酶解提取法提取率最高，绝对误差值最小，酶解法提取率为12.1%，回收率为97.3%，精密度为1.2%，综上所述银耳多糖提取的3种方法中酶解提取法为最佳方法。再对酶解提取法的影响因素进行探讨，得出酶解法的最佳提取条件为：纤维素酶添加量为1.5%，纤维素酶添加量为0.5%，中性蛋白酶添加量为2.0%，反应温度为50℃，pH为4.5，反应时间为60 min，银耳多糖的最高提取率为15.36%。通过稳定性实验证明温度和pH对银耳多糖的提取液的影响极小，可忽略不计，从而说明银耳多糖的提取液具有良好的稳定性，可以广泛应用于各类pH范围的银耳多糖产品中，并能保证产品在长期存放过程中的稳定性。白砂糖对银耳多糖的提取液黏度有提升作用，白砂糖的增加不影响银耳多糖提取液的质量，在银耳多糖的产品中可根据产品口感的要求向产品中加入适量的白砂糖。乳酸添加会降低提取液的黏度，影响银耳多糖提取液的质量，在银耳多糖的产品中要少加入乳酸以保证产品的质量。本文通过实验为建立方便、高效的多糖提取途径提供了参考，为银耳多糖的进一步开发利用提供了参考。

［1］魏国志，李国光，金梅红．银耳多糖的研究进展［J］．香料香精化妆品，2008，4（2）：33-35

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Study on Extraction Technology and Stability of Tremella Polysaccharide by Enzymatic Hydrolysis

BAO Hui-mei
（Jiangsu food and drug of Career Technical College College of food science and Nutritional Engineering Huai'an 223003，Jiangsu，China）

To deep processing of tremella polysaccharide.In this paper，enzymatic hydrolysis extraction of tremella polysaccharide extraction condition was optimized.Enzymatic hydrolysis the highest extraction rate was 15.36%，the recovery rate of 97.3%，the precision of 1.2%，the best conditions for：cellulase 1.5%，0.5% cellulase and 2.0%acid protease，temperature 50℃，pH4.5，time for 60 min.Through experiment that the temperature and pH on the polysaccharide extract，extract has a good stability.Sugar has promoting effect to the extract，lactic acid and vice.Enzymatic hydrolysis.is a kind of mild conditions，the extraction methods of saving energy consumption，high extraction yield.

tremella；polysaccharides；extraction；impact

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.004

2013-12-03

鲍会梅（1974—），女（汉），副教授，硕士，主要从事食品理化检验技术教学工作。