尼克酰胺对急性肝功能衰竭小鼠的保护作用*

崔小兰 李大伟 夏 强

上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科(200127)

急性肝功能衰竭(AHF)是多种因素作用引起的一组临床综合征，具有较高病死率。除肝移植外，目前尚无有效的治疗方法，因此，早期干预AHF具有重要的研究价值和临床意义。尼克酰胺是一种水溶性B3组维生素，可从膳食中获取，也可通过烟酸合成。内源性尼克酰胺参与广泛的生物代谢过程，包括能源合成和脂肪酸合成等［1］。多年来，尼克酰胺已被用于治疗各种疾病，如糙皮病、银屑病、精神分裂症、Ⅰ型糖尿病等［2-4］。最近，诸多文献报道尼克酰胺在体内和体外均具有抗炎作用，可减少脂多糖(LPS)引起的炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6的释放，以及对丙酸杆菌引起角化细胞趋化因子IL-8生成的抑制［5-7］。在内毒素引起的肺部炎症小鼠模型中，尼克酰胺明显可降低肺部炎性细胞和炎症因子水平。此外，尼克酰胺对心脏缺血再灌注损伤和脑创伤均有保护作用［8-9］。本文旨在研究尼克酰胺在AHF小鼠模型中是否也有抑制炎症和保护的作用。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

1.实验动物:雄性C57BL/6小鼠94只，8～12周，体质量20～26 g，无固定病原体级，购自中国科学院上海实验动物中心。昼夜规律光照，小鼠自由进食、进水。

2.仪器和试剂:D-半乳糖胺、LPS来源于大肠杆菌，尼克酰胺购自美国Sigma公司;TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒购自深圳市达科为生物技术公司;肝细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;抗Cleaved-Caspase-3抗体(1∶200稀释)购自美国Cell Signaling Technology公司;β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司。

二、动物分组以及AHF模型制备

1.基础实验:抽取54只小鼠按随机表法分为6组，每组9只。空白对照组小鼠未给予任何处理;尼克酰胺对照组小鼠腹腔注射尼克酰胺1000 mg/kg;将D-半乳糖胺700 mg/kg和 LPS 10 μg/kg溶解于0.2 mL 0.9%NaCl溶液后腹腔注射制备 AHF模型;尼克酰胺低、中、高剂量组小鼠分别腹腔注射尼克酰胺400、800、1000 mg/kg 1 h后制备AHF模型。

2.生存率实验:将剩余40只小鼠随机分为5组，每组各8只。AHF模型组建模方法同上文;0.9%NaCl溶液组:建模前 1 h腹腔注射 0.2 mL 0.9%NaCl溶液;尼克酰胺低、中、高剂量组:建模前1 h分别腹腔注射尼克酰胺400、800、1000 mg/kg。

三、检测指标

1.基础实验指标的检测:建模6 h后，6组小鼠腹主动脉采血，室温静置1 h后2000×g 4℃离心30 min，分离血清，测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。门静脉灌注4%多聚甲醛固定小鼠肝组织，梯度浓度乙醇脱水，石蜡包埋，切片(厚5 μm)，HE染色，于光镜下观察肝组织病理学改变。采用ELISA法检测TNF-α和IL-6水平;采用TUNEL染色，荧光共聚焦显微镜下观察肝细胞凋亡并拍照。留取部分肝组织提总蛋白，以蛋白质印迹法检测Caspase-3表达。

2.生存率观察:观察5组小鼠于建模后72 h内的死亡情况和死亡时间。

四、统计学分析

结 果

一、血清转氨酶水平

空白对照组ALT和AST水平与尼克酰胺对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。AHF模型组ALT［(2799.00 ±384.35)U/L］和 AST［(3362.78 ±483.05)U/L］较两个对照组明显增高(P ＜0.05)。与AHF模型组相比，尼克酰胺低、中、高剂量组ALT和AST水平显著降低(P＜0.05)，且呈剂量依赖性(P ＜0.05)(图1)。

二、肝组织病理学检查

空白对照组和尼克酰胺对照组肝细胞呈条索状排列，肝窦排列规则，未见炎性细胞浸润;AHF模型组肝细胞肿胀，肝窦严重淤血，可见片状坏死和散在的中性粒细胞浸润;与AHF模型组相比，尼克酰胺不同剂量组肝组织损伤减轻，肝细胞肿胀明显减轻，肝窦淤血少见，未见坏死，少量中性粒细胞浸润(图2)。

三、血清炎症因子水平

空白对照组TNF-α和IL-6水平与尼克酰胺对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05);AHF模型组分别为(1408.67 ±139.84)pg/mL 和(3408.67 ±167.49)pg/mL，较两个对照组明显升高(P＜0.05)。与AHF模型组相比，尼克酰胺低、中、高剂量组TNF-α和IL-6水平均显著降低(P＜0.05)，且呈剂量依赖性(P＜0.05)(图3)。

图1 各组小鼠血清转氨酶水平

图2 各组肝组织病理学表现(HE染色，×200)

图3 各组小鼠血清TNF-α和IL-6水平

四、肝细胞凋亡和肝组织内Caspase-3蛋白表达情况

与空白对照组相比，尼克酰胺对照组肝细胞凋亡和肝组织内Caspase-3蛋白表达无明显差异。与两个对照组相比，AHF模型组肝细胞凋亡和肝组织内Caspase-3蛋白表达均明显升高(P＜0.05)。与AHF模型组相比，尼克酰胺低、中、高剂量组肝细胞凋亡和Caspase-3蛋白表达明显降低(P＜0.05)，且呈剂量依赖性(P ＜0.05)(图4、5)。

五、小鼠生存情况

AHF模型组和0.9%NaCl溶液组8只小鼠于72 h内均死亡，生存率为0%。尼克酰胺低、中、高剂量组72 h内分别死亡5只、3只和0只小鼠，生存率分别为37.5%、62.5%和100%，较AHF模型组和0.9%NaCl溶液组明显增加，死亡率明显减少(P ＜0.05)(图6)。

讨 论

AHF的病理特点是肝细胞在短期内出现大量死亡，临床特点是肝功能迅速恶化，引起肝性脑病、凝血功能障碍等急性并发症，病情进展迅速，死亡率高。D-半乳糖胺联合LPS腹腔注射诱导AHF小鼠模型是研究急性肝损伤十分理想的动物模型，有利于治疗的评估和潜在致病机制的研究［10-12］。血清转氨酶ALT和AST是评价肝损伤的重要指标，两者水平高低可提示肝损伤的严重程度［13］。本研究显示，尼克酰胺可显著降低小鼠血清ALT和AST水平，对急性肝损伤有保护作用，肝组织病理结果进一步证实了这种保护作用。TNF-α是D-半乳糖胺联合LPS诱导的急性肝损伤中最主要的炎症介质，可引起炎症介质的级联反应，导致大量肝细胞凋亡和坏死［14-15］。有文献［16］报道，抑制 TNF-α 的合成和释放可减轻肝损伤。IL-6也是D-半乳糖胺联合LPS诱导的急性肝损伤中重要的炎症因子，肝损伤后伴随TNF-α和IL-6明显升高［17-21］。目前认为导致AHF的机制为D-半乳糖胺特异性地将肝细胞磷酸尿嘧啶核苷消耗殆尽，LPS引起肝脏Kupffer细胞高度活化，从而使其释放大量活性介质，如TNF-α和IL-6等，最终导致肝细胞弥漫性坏死、凋亡，肝功能严重障碍甚至发生器官衰竭［22-24］。尼克酰胺是B族维生素成员，文献报道尼克酰胺有明显的抑制炎症作用，可减少炎症因子TNF-α和IL-6的释放，明显减轻肝细胞坏死和凋亡［25］。本研究通过预先腹腔注射不同剂量的尼克酰胺，观察小鼠血清转氨酶、TNF-α和IL-6水平、肝脏病理损伤和生存率，旨在评价尼克酰胺对AHF的作用。结果显示，尼克酰胺能明显降低小鼠血清转氨酶水平和TNF-α、IL-6水平，肝组织病理损伤明显减轻;尼克酰胺预处理能明显降低肝组织内凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平，减少肝细胞凋亡，并明显提高小鼠生存率。

图4 各组肝细胞凋亡情况(TUNEL染色，×200)

图5 各组小鼠肝组织内Caspase-3蛋白表达(蛋白质印迹法)

图6 各组小鼠生存率情况

综上所述，尼克酰胺通过抑制炎症因子TNF-α和IL-6的释放，减轻肝损伤时的炎症反应，同时抑制肝细胞凋亡，从而保护D-半乳糖胺联合LPS引起的急性肝损伤，具有潜在的临床治疗作用。

1 Sauve AA.NAD+and vitamin B3:from metabolism to therapies［J］.J Pharmacol Exp Ther，2008，324(3):883-893.

2 Maiese K，Chong ZZ，Hou J，et al.The vitamin nicotinamide:translating nutrition into clinical care［J］.Molecules，2009，14(9):3446-3485.

3 Niren NM.Pharmacologic doses of nicotinamide in the treatment of inflammatory skin conditions:a review［J］.Cutis，2006，77(1 Suppl):11-16.

4 Namazi MR.Nicotinamide:a potential addition to the antipsoriatic weaponry［J］.FASEB J，2003，17(11):1377-1379.

5 Biedroń R，Ciszek M，Tokarczyk M，et al.1-Methylnicotinamide and nicotinamide:two related anti-inflammatory agents that differentially affect the functions of activated macrophages［J］.Arch Immunol Ther Exp(Warsz)，2008，56(2):127-134.

6 Grange PA，Raingeaud J，Calvez V，et al.Nicotinamide inhibits propionibacterium acnes-induced IL-8 production inkeratinocytesthrough the NF-kappaB and MAPK pathways［J］.J Dermatol Sci，2009，56(2):106-112.

7 Fernandes CA，Fievez L，Ucakar B，et al.Nicotinamide enhances apoptosis of G(M)-CSF-treated neutrophils and attenuates endotoxin-induced airway inflammation in mice［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，300(3):L354-L361.

8 Sukhodub A，Du Q，Jovanovic S，et al.Nicotinamide-rich diet protects the heart against ischaemia-reperfusion in mice:a crucial role for cardiac SUR2A［J］.Pharmacol Res，2010，61(6):564-570.

9 Goffus AM，Anderson GD，Hoane M.Sustained delivery of nicotinamide limits cortical injury and improves functional recovery following traumatic brain injury［J］.Oxid Med Cell Longev，2010，3(2):145-152.

10 Wan JY，Gong X，Zhang L，et al.Protective effect of baicalin against lipopolysaccharide/D-galactosamineinduced liver injury in mice by up-regulation of heme oxygenase-1［J］.Eur J Pharmacol，2008，587(1-3):302-308.

11 Wang K，Damjanov I，Wan YJ.The protective role of pregnane X receptor in lipopolysaccharide/D-galactosamineinduced acute liver injury［J］.Lab Invest，2010，90(2):257-265.

12 Lin X，Zhang S，Huang R，et al.Protective effect of tormentic acid from Potentilla chinensis against lipopolysaccharide/D-galactosamine induced fulminant hepatic failure in mice［J］.Int Immunopharmacol，2014，19(2):365-372.

13 Nyblom H，Berggren U，Balldin J，et al.High AST/ALT ratio may indicate advanced alcoholic liver disease rather than heavy drinking［J］.Alcohol Alcohol，2004，39(4):336-339.

14 Lee WC，Jung HA，Choi JS，et al.Protective effects of luteolin against apoptotic liver damage induced by D-galactosamine/lipopolysaccharide in mice［J］.J Nat Prod，2011，74(9):1916-1921.

15 Yu DS，An FM，Gong BD，et al.The regulatory role of microRNA-1187 in TNF-alpha-mediated hepatocyte apoptosis in acute liver failure［J］.Int J Mol Med，2012，29(4):663-668.

16 Iimuro Y，Gallucci RM，Luster MI，et al.Antibodies to tumor necrosis factor alfa attenuate hepatic necrosis and inflammation caused by chronic exposure to ethanol in the rat［J］.Hepatology，1997，26(6):1530-1537.

17 Ben-Ari Z，Zilbermints V，Pappo O，et al.Erythropoietin increases survival and attenuates fulminant hepatic failure injury induced by D-galactosamine/lipopolysaccharide in mice［J］.Transplantation，2011，92(1):18-24.

18 Xia X，Su C，Fu J，et al.Role of alpha-lipoic acid in LPS/d-GalN induced fulminant hepatic failure in mice:studies on oxidative stress，inflammation and apoptosis［J］.Int Immunopharmacol，2014，22(2):293-302.

19 Liu H，Wu X，Dong Z，et al.Fatty acid synthase causes drug resistance by inhibiting TNF-alpha and ceramide production［J］.J Lipid Res，2013，54(3):776-785.

20 McGrath KC，Li XH，Whitworth PT，et al.High density lipoproteins improve insulin sensitivity in high-fat diet-fed mice by suppressing hepatic inflammation［J］.J Lipid Res，2014，55(3):421-430.

21 Yu H，Valerio M，Bielawski J.Fenretinide inhibited de novo ceramide synthesis and proinflammatory cytokines induced by Aggregatibacter actinomycetemcomitans［J］.J Lipid Res，2013，54(1):189-201.

22 Xu FL，You HB，Li XH，et al.Glycine attenuates endotoxininduced liver injury by downregulating TLR4 signaling in Kupffer cells［J］.Am J Surg，2008，196(1):139-148.

23 Liu LM，Zhang JX，Luo J，et al.A role of cell apoptosis in lipopolysaccharide(LPS)-induced nonlethal liver injury in D-galactosamine(D-GalN)-sensitized rats［J］.Dig Dis Sci，2008，53(5):1316-1324.

24 Ganz M，Csak T，Nath B，et al.Lipopolysaccharide induces and activates the Nalp3 inflammasome in the liver［J］.World J Gastroenterol，2011，17(43):4772-4778.25 Yuan H，Wan J，Li L，et al.Therapeutic benefits of the group B3 vitamin nicotinamide in mice with lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis［J］.Pharmacol Res，2012，65(3):328-337.