彩叶凤梨离体培养中外植体消毒及防止褐化的研究

史华平 王彦尊 王计平

摘要

[目的]研究彩叶凤梨离体培养过程中外植体消毒及褐化的防止措施。 [方法]以彩叶凤梨幼苗茎段作为外植体材料，研究其消毒和褐化防止问题。[结果]减少培养基中无机盐浓度，外植体选用0.1%升汞溶液消毒10 min，并在MS诱导培养基中添加200 mg/L的抗坏血酸，能够有效防止褐化，而且不影响愈伤组织的进一步分化。[结论]研究结果为彩叶凤梨离体培养奠定基础。

关键词 彩叶凤梨;离体培养;外植体;消毒;褐化

中图分类号 S188  文献标识码

A  文章编号 0517-6611（2015）03-047-03

Studies on Disinfection and Antibrowning during the Tissue Culture of Neoregelia carolinae

SHI Huaping¹， WANG Yanzun²， WANG Jiping2*

（1. Pomology Institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taigu， Shanxi 030815; 2.College of Agronomy， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801）

Abstract  [Objective] The aim was to study disinfection and antibrowning during the tissue culture of Neoregelia carolinae.

[Method ] In this experiment， with the seedling stems of Neoregelia carolinae as explants， study on the problems in disinfection and browning of Neoregelia carolinae tissue culture was carried out. [Result]Results showed that the explant browning could be alleviated by reducing the salt concentration of medium and explants treated with 0.1% HgCl₂ for 10 min during in vitro culture. Results also showed that the medium supplemented with 200 mg/L Vc could prevent browning effectively， and did not produce bad effects on growth of Neoregelia carolinae explants.[Conclusion] The study provided basis for tissue culture of Neoregelia carolinae.

Key words   Neoregelia carolinae; Tissue culture; Explant; Disinfection; Browning

基金项目 山西省科技攻关项目（20130311019-2）;國家自然科学基金项目（31201266）。

作者简介 史华平（1974- ），男，山西昔阳人，助理研究员，从事植物组织培养技术研究。*通讯作者，副教授，博士，从事植物生理与分子生物学研究。

收稿日期 20141205

彩叶凤梨（Neoregelia carolinae）又名赪凤梨、五彩凤梨，为凤梨科彩叶凤梨属植物。原产于巴西，无明显休眠期，喜温暖、湿润和阳光充足的环境，不耐寒，怕干燥和强光暴晒^[1]。我国彩叶凤梨的栽培时间不长，从20世纪80年代开始进入引种阶段，至今仅有小批量的生产，主要集中在广东、海南、福建和云南昆明等地。

彩叶凤梨通常以分株、播种繁殖为主，时间限制十分明显，而且生长缓慢，繁殖率低，且苗不整齐，通过植物组织培养技术可以大大提高其繁殖率^[1-2]，短期内获得大量整齐一致的种苗，因此通过组织培养快速繁殖凤梨是一条很理想的途径。然而，在离体培养过程中，首先遇到的是外植体严重褐化而导致培养物死亡的问题，笔者针对该问题，对彩叶凤梨离体培养过程中外植体消毒及褐化的防止措施进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以山西农业大学农学院组培试验室提供的彩叶凤梨为材料，取其幼苗茎段作为外植体材料。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的处理与消毒。

1.2.1.1 材料预处理。

取彩叶凤梨幼苗，流水冲洗干净，切下其茎段，在无菌条件下用75%乙醇表面消毒30 s，用消毒剂消毒，最后无菌水清洗6～8次，用无菌滤纸吸干材料表面水分后备用。

1.2.1.2 表面消毒剂的筛选。分别用2%、5%NaClO及01%、0.2%的HgCl₂溶液按如下设置进行外植体消毒。①2%的NaClO消毒10 min;②2%的NaClO消毒20 min;③2%NaClO消毒30 min;④5%的NaClO消毒10 min;⑤5%NaClO消毒20 min;⑥5%NaClO消毒30 min;⑦0.1%HgCl₂溶液消毒5 min ;⑧0.1%HgCl₂溶液消毒10 min;⑨0.2%HgCl₂溶液消毒5 min;⑩0.2%HgCl₂溶液消毒10 min。每处理20个外植体，重复3次。

1.2.1.3 外植体处理时间的确定。

用0.1%HgCl₂溶液按以下时间设置对茎段外植体进行消毒处理。①0.1%HgCl₂溶液消毒3 min;②0.1%HgCl₂溶液消毒5 min;③0.1%HgCl₂溶液消毒7 min;④0.1%HgCl₂溶液消毒10 min;⑤0.1%HgCl₂溶液消毒15 min。消毒的外植体接种于无菌培养基上。培养基配方为MS+6BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，附加0.6%琼脂和3%蔗糖，pH 5.6～5.8。每处理20个外植体，重复3次。培养20 d后，统计外植体污染率，死亡率，存活率。

1.2.2 外植体褐化的防止。研究不同基本培养基及消毒剂的种类和处理方法对外植体褐化的影响，每个处理接种20个，设3次重复。

1.2.2.1 不同消毒剂处理对外植体褐化的影响。

取彩叶凤梨的幼苗茎段，流水洗净后设6个处理：①在无菌条件下用75%乙醇表面消毒30 s后，于0.1%HgCl₂溶液消毒7 min;②用75%乙醇表面消毒30 s后，于0.1%HgCl₂溶液消毒10 min;③用75%乙醇表面消毒30 s后，于0.1%HgCl₂溶液消毒15 min;④直接用0.1%HgCl₂溶液消毒7 min;⑤直接用01%HgCl₂溶液消毒10 min;⑥直接用0.1%HgCl₂溶液消毒15 min。

1.2.2.2 不同基本培养基对外植体褐化的影响。

将基本培养基设为MS、1/2MS、N6和B5 4种类型，分别附加6BA 3.0 mg/L及NAA 0.1 mg/L，分析不同培养基类型对彩叶凤梨外植体褐化的影响。

1.2.2.3 不同浓度抗坏血酸处理对外植体褐化的影响。在培养基中添加不同浓度抗坏血酸（Vc），以没有任何防褐化处理的外植体作为对照，筛选抗坏血酸防止外植体褐化的最适浓度。

2 结果与分析

2.1 外植体材料的处理

2.1.1 消毒剂对外植体消毒效果的影响。

从表1可以看出，2% NaClO处理10 min的污染率达到62.1%，存活率为34.4%，而5% NaClO处理20和30 min的存活率达到68%左右;01%和0.2% HgCl₂消毒5和10 min的存活率均保持在70%以上;表明2种灭菌剂对彩叶凤梨幼苗茎段外植体消毒效果之间存在显著差异，不同浓度HgCl₂消毒效果均优于NaClO，污染率降低，存活率提高。对存活率分析表明，处理⑧是彩叶凤梨茎段外植体较适宜的消毒方法，即0.1% HgCl₂消毒10 min，外植体存活率高达92.6%。

表1 消毒剂对茎段消毒效果的影响

%

處理污染率死亡率存活率

①62.1 3.534.4

②45.22.652.2

③36.0 3.061.0

④58.2 4.337.5

⑤23.5 8.468.1

⑥17.6 14.867.6

⑦14.2 11.874.0

⑧2.05.492.6

⑨8.3 5.286.5

⑩1.8 18.479.8

2.1.2 处理时间对外植体消毒效果的影响。

为了进一步确定0.1%HgCl₂对外植体材料的最佳处理时间，分别设置了5个处理时间进行消毒，结果见表2。由表2可知，随着处理时间的延长，外植体污染率逐渐降低，死亡率升高，说明较长时间HgCl₂处理会对外植体材料造成一定伤害。5个不同处理时间中，0.1%HgCl₂处理3 min外植体的死亡率虽然是0，但外植体的污染率却达到64.5%，存活率也只有35.5%;而用0.1%HgCl₂处理7～15 min，虽然外植体有一定的污染，但死亡率较低，其存活率在80%左右，结果表明，处理④即0.1% HgCl₂消毒10 min，外植体存活率高达92.6%，消毒效果最好，是较适宜的外植体处理时间。

表2 处理时间对外植体材料消毒效果的影响

%

处理污染率死亡率存活率

①64.5035.5

②14.211.874.0

③8.5 10.381.2

④2.05.492.6

⑤2.318.179.6

2.2 外植体褐化的防止

2.2.1 不同表面消毒方式对外植体褐化的影响。由表3可知，用75%乙醇处理外植体材料，明显加剧了褐化程度，处理后1 d即出现中度褐化;0.1%HgCl₂溶液消毒10或15 min，褐化现象也较明显，而用0.1%HgCl₂溶液消毒7 min，外植体褐化程度较轻，表明用0.1%HgCl₂溶液消毒处理对褐化的影响较小。

表3 不同表面消毒方式对外植体褐化的影响

处理处理时间∥d

1234

①+++++++++++

②+++++++++++

③++++++++++++

④++++++++

⑤+++++++++

⑥+++++++++++

注：N.没有褐化，+.轻度褐化，++.中度褐化，+++.严重褐化。

2.2.2 不同基本培养基对外植体褐化的影响。

过高无机盐浓度会引起某些植物外植体中酚类物质氧化，引起褐变;培养基的状态及硬度也会影响外植体褐化程度。以MS培养基作为对照，分别附加相同激素成分，蔗糖3%，琼脂0.6%，pH 5.6～5.8。

表4 基本培养基对外植体褐化的影响

培养基处理时间∥d

1234

MS++++++++

1/2MS+++++++

N6+++++++

B5+++++++

注：N.没有褐化，+.轻度褐化，++.中度褐化，+++.严重褐化。

由表4可知，MS培养基比其他培养基褐化速度更快，而其他3种培养基之间则无明显差异。

2.2.3 不同浓度抗坏血酸对外植体褐化的影响。

在MS培养基中添加50、100、200和300 mg/L抗坏血酸，对外植体褐化有一定的抑制效果（表5），其中，较低浓度抗坏血酸在培养初期有防褐作用（50 mg/L在6d前，100 mg/L在8d前），200和300 mg/L抗坏血酸能够很好地防止彩叶凤梨外植体褐化的产生。

防褐化剂对愈伤组织和不定芽的产生有不同的影响，所以在添加抗坏血酸的培养基中培养茎段20 d时，对不定芽和愈伤组织的产生进行了记录，发现都有不定芽的产生，叶片也有愈伤组织的产生，因此认为，在培养基中添加200 mg/L的抗坏血酸能够较好地防止褐化，且不影响分化。

表5 不同浓度抗坏血酸对外植体褐化的影响

抗坏血酸浓度

mg/L处理时间∥d

4681020

对照++++++++++++++

50+++++++++++++

100+++++++++++

200NNN++

300NNN++

注：N.没有褐化，+.轻度褐化，++.中度褐化，+++.严重褐化。

3 结论与讨论

3.1 外植体的选择及灭菌

外植体是植物组织培养的材料，其表面和内部常携带一些微生物，是组织培养过程的主要污染源，外植体的消毒是植物组织培养能否成功的第一步，在培养时常因消毒效果不佳而导致失败。外植体表面消毒的关键是选择合适的消毒剂和消毒时间。因为消毒剂不仅能杀死微生物，也会对外植体产生一定的伤害。不同植物或同一植物不同外植体消毒方法不同，为达到满意的灭菌效果，需要根据外植体的情况，选择合适的消毒剂，摸索出合理的消毒时间，焦立为等^[3]用臭氧对橡皮树带有顶芽的叶片进行消毒，结果表明，臭氧用于外植体消毒灭菌的效果很好，接种20 d后，污染率为0%，且顶芽（有鳞叶包被）接种后的成活率极高;Abdul Qayyum Rao 等^[4]采用0.1%HgCl₂对棉花种子表面消毒时，种子在消毒液中浸泡20  min，远远超出一般时间范围，但仍不会对种子造成伤害。在使用消毒剂时，有时只用1种消毒剂对外植体进行消毒，有时是将2种或几种消毒液混合后对外植体进行消毒，刘香玲等^[5]使用混合消毒剂对水稻种子进行灭菌，将水稻种子去壳后，先用70%乙醇消毒1 min，再用0.1%HgCl₂和2% NaClO（1∶1）的混合消毒液浸泡20 min。该研究对彩叶凤梨幼苗茎段采用0.1%HgCl₂消毒10 min，其存活率可达92.6%。

3.2 外植体褐化及防止

外植体褐化是凤梨科植物等许多植物离体培养过程中的常见问题，发生褐化现象会直接导致培养物死亡，严重阻碍了快繁过程。影响褐化的因素很多，也很复杂，植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态、外植体消毒情况、培养方式等的不同，褐化程度也有所不同。首先，接種时各种化学消毒剂对外植体的伤害会引起褐化。消毒剂不同，消毒时间不同，外植体褐化程度也不同。乙醇消毒虽然效果较好，但易对材料造成伤害，导致褐化，HgCl₂对外植体伤害较轻，且消毒时间越长，效果越好，但褐变越严重^[6]。在消毒时间方面，一般是消毒时间越长，褐化率越高^[7]，因而消毒时间应掌握在一定范围内才能保证较高的外植体成活率。该研究用0.1%HgCl₂溶液消毒7 min，外植体褐化程度较轻，而75%乙醇处理外植体材料，明显加剧了褐化程度。

其次，培养基状态及过高的无机盐浓度也会引起外植体褐变，如把核桃分别在固体、半固体和液体培养基上培养，半固体培养基芽的诱导获得成功，而其他培养基上都发生了褐变^[8]。在金钱树愈伤组织诱导过程中，采用液体培养对防止褐化有很好的作用^[9]。在桑树组培中，降低无机盐浓度，将MS培养基改为1/2MS培养基能减轻褐变，降低褐化率^[10]。刘兰英^[11]在核桃组培中发现，将DKW培养基的无机盐浓度减少一半，核桃外植体褐变率由55.8%降至32.5%。该研究结果表明MS培养基比1/2MS、N6及B5培养基褐化速度更快。

另外，在培养基中加入防褐化剂可以明显减少褐变发生。防褐化剂一般分为2种：一种是吸收醌类物质的吸附剂，如活性炭，它是一种吸附性较强的吸附剂，但其吸附作用没有选择性，在吸附酚类氧化物的同时也吸附营养物质，研究表明，活性炭能有效控制褐化和促进生长，但不利于分化^[12];另一种是防止酚氧化的抗氧化剂，如Na₂SO₃和NaHSO₃，主要是影响酚类化合物与酶结合来有效防止褐化，抗坏血酸（Vc）也属于抗氧化剂，是一种酚氧化酶抑制物，它可以将该酶的Cu²⁺还原成Cu+^[13]。虽然Na₂SO₃的防褐化作用最佳，但不利于不定芽和愈伤组织的发生，影响外植体培养。彭筱娜等^[14]研究表明，在培养基中添加200 mg/L抗坏血酸可以有效防止观赏凤梨褐化的产生。该试验同样采用200 mg/ L的抗坏血酸作为一种有益的防褐化添加物，也可以有效防止彩叶凤梨茎段外植体褐化，促进外植体的培养。

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