水中细菌总数测定方法的改进

李巍

【摘 要】通过实验来比较水中细菌总数测定的三种培养方法，筛选出更灵敏的接种方法——双层培养法，该方法简便，实用性强，便于推广使用。

【关键词】水中细菌总数；测定；改进

0.前言

水是微生物广泛分布的天然环境，水中微生物种类及数量因水源不同而异。当水体受到污染时，水中微生物的数量可大量增加。但直接检查水中的各种病原微生物，方法较复杂，有的难度大。所以，在实际工作中经常以测定细菌总数来判断水的污染程度。细菌作为水体中主要的微生物类群，在表征水体污染程度等方面发挥着重要作用。但笔者发现测定细菌总数，在37℃培养24小时开始菌落计数，发现计数结果总是偏低。通过多次实验，认为从以下几方面加以改进，可以提高细菌检出率，减少不确定度。

1.材料与试剂

材料： 高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、恒温水浴箱、电热干燥箱、冰箱、灭菌三角瓶、灭菌的具塞三角瓶、灭菌平皿、灭菌吸管、调温电炉。

试剂：营养琼脂培养基、灭菌水。

2.原理

细菌总数测定是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异氧菌密度的方法。因为细菌能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在。本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数，通过计数在一定的培养基平板上生长的菌落数，来获得水中细菌的总数。细菌总数是指lmL或1g检样中所含细菌菌落的总数，它反应了水样中活菌的数量。

3.实驗方法

3.1水样的稀释

选择适宜的稀释度，以期在平皿上的菌落总数介于30～300之间。稀释方法如下：以无菌操作方法吸取10mL充分混匀的水样，注入盛有90mL灭菌水的三角烧瓶中，混匀制成1：10稀释液。吸取1：10的稀释液lmL注入盛有9mL灭菌水的三角烧瓶中，混匀制成1：100稀释液。按同法依次稀释成其他的稀释倍数。传统的混匀稀释液的方法是用吸管反复吹吸数次来完成的。而笔者采用的是振摇的方法，即在三角烧瓶中放入灭菌玻璃珠然后振摇稀释液，以使其充分混匀。而不必用吸管上吹下吸，这样即省时又省力。

3.2操作方法

（1）倾注法是以无菌操作方法用1mL灭菌吸管吸取充分混匀的水样注入灭菌平皿中，再倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。待琼脂冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于37℃恒温箱内培养24小时。进行菌落计数。其优点是：1）通用；2）较易使菌落均匀分布，计数容易；3）取样量大，结果重现性好。缺点是：1）该法不利于严格好氧菌的繁殖生长，分布在培养基内的部分细胞所形成的菌落较小，甚至无法形成菌落，2）加上有些活菌受热损伤，使检测到的细菌总数偏低。

（2）涂布法是将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将0.1mL或0.2mL的样品悬液滴加在固体培养基表面，再用无菌玻璃涂棒将样品均匀分散至整个培养基表面，待样品被完全吸收后倒置培养。其优点是：1）可以检测到热敏性菌体；2）菌落生长在培养基表层，体积大，形态明显；3）更适合严格的好氧菌。其缺点是：1）不易使菌落分布均匀，有时菌落过大，导致蔓延生长和互相融合，形成链状、片状影响计数；2）等待时间长，涂布棒用酒精火焰灼烧后，需放置数分钟等其完全冷却才能使用；3）0.1～0.2mL水样涂布在固体培养基表面后需放置约10分钟等水样被渗透吸收后才能倒置，因此涂布法的使用并不广泛，只在特殊情况下使用。

（3）双层培养法首先制作营养琼脂平板作为底层培养基：平皿内加入适量营养琼脂，冷却凝固后备用；然后吸取不同稀释度水样1mL，注入上述平板，倾倒少量融化的营养琼脂作为上层培养基，转动平板使混合均匀，待水样渗透、琼脂凝固后翻转平板培养。其优点是：克服了倾注法和涂布法的各自缺点，综合了两者优点。

4.实验部分

三种方法检测结果如下

注：采样点为崔东河。

检测结果比较：双层培养法菌落计数约是倾注法2倍，涂布法约是倾注法的1.5～2.5倍。

5.结果与分析

三种培养方法比较：双层培养法比涂布法容易，比倾注法灵敏，方法简便，实用性强，便于推广使用。细菌总数多寡反映水体有机物污染程度，检验意义极大。通过实验筛选出更灵敏的接种方法—双层培养法，优化稀释方法可以最大限度促进活菌生长，得到比较全面的菌落总数，真实反映水体状况，为水质评价提供可靠依据。 [科]