高效纤维素降解真菌的筛选及粗酶活性

许凤华等

摘要[目的]筛选纤维素酶活力高的纤维素降解真菌，研究其粗酶活性。[方法]从土壤中分离、筛选高效纤维素降解菌，以透明圈试验和滤纸降解试验验证其降解能力，通过菌落菌丝形态及rDNA-ITS序列测序鉴定菌株种属，通过改变培养时间、氮源、装液量、起始pH及培养温度5个因素探讨纤维素降解真菌的最适产酶条件。[结果]得到3株纤维素降解真菌QS2、QS6和QW9，经鉴定确定QS2和QS6属青霉属（Penicillium），QW9为康宁木霉（Trichoderma koningii）。QS6菌株的FPA酶活和CMC酶活在3个菌株中均表现活力最高，且最适产酶条件为32 ℃时氮源为磷酸铵、起始pH 6.0、装液量100 ml，培养时间14 d。[结论]高效纤维素降解真菌粗酶活性的研究为纤维素酶的发酵生产提供一定的技术支持。

关键词纤维素；真菌；降解能力；FPA酶活；CMC酶活

纤维素（cellulose）是由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上[1]。同时，纤维素也是一种可再生资源，能被很多种微生物有效转化为单糖，并通过后续的加工来生产乙醇等能源物质或其他工业产品。目前，研究较多的包括木霉（Trichoderma）、曲霉（Aspergillus）、青霉（Penicillium）和纤维单胞菌属（Cellulomonas）、纤维弧菌属（Cellvibrio）等[2]。

纤维素酶是降解纤维素成为葡萄糖单体所需的一组酶的总称。它不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系，一般认为主要包括内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）、β葡萄糖苷酶三类酶组分[3-4]。纤维素酶的发酵生产及高酶活性的保持一直是纤维素酶在生产应用中亟待解决的问题。笔者拟从土壤中分离高效纤维素降解菌，筛选出酶活较高的纤维素降解菌，并进行分子鉴定，同时对其粗酶活性进行分析。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品的采集。采集大庆森林公园多年生针叶林落叶底层的土壤，进行纤维素降解真菌的筛选及分离、纯化。

1.1.2培养基的配制。筛选培养基：NaCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，KH2PO4 0.5 g，CMCNa 2.0 g，蛋白胨1 g，刚果红0.2 g，琼脂条20 g，蒸馏水1 000 ml（自然pH），灭菌冷却；

PDA培养基：葡萄糖20 g，20%土豆汁1 L，pH自然，最后定容到1 000 ml；

产酶培养基：KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl2 02 g，FeCl3 0.03 g，NaCl 0.1 g，滤纸片20 g，定容到1 000 ml，pH 72～7.5。

1.2方法

1.2.1纤维素降解真菌的筛选及分离、纯化。将土壤样品过筛，去除杂草、石块等杂物，称取3 g土壤样品，放入无菌水中充分悬浮，静置1 h后吸取上清液，进行梯度稀释，分别获得原液、10-1、10-2、10-3以及10-4的菌液，各取100 μl均匀涂布在筛选培养基上，28 ℃倒置培养。待长出菌落后，挑取长势良好的不同菌落形态的真菌在PDA培养基上进行反复三区划线，直至得到纯化的单菌落，再切下单菌落边缘部分接种到PDA平板上，28 ℃倒置培养作为种子。

1.2.2纤维素降解真菌的鉴定。挑取纯种的真菌菌丝，加入50 ml液体PDA培养基中，28 ℃，140 r/min振荡培养约3 d，将菌液中的菌丝过滤抽干，利用CTAB法进行基因组DNA的提取，利用ITS引物扩增18S rDNA序列，经测序后在NCBI上进行比对，确定菌株的近源种。

1.2.3纤维素降解真菌降解能力的测定。

1.2.3.1透明圈法。在以纤维素为唯一碳源的固体培养基上接种纤维素降解真菌，28 ℃培养3 d，测定菌落直径（d，cm）和水解圈直径（D，cm），用HC[5]表示水解能力。

HC =（D/d）2

1.2.3.2滤纸条降解法。将直径约1 cm纤维素降解真菌菌块接种于50 ml以滤纸块为唯一碳源的液体培养基中，80 r/min，28 ℃振荡培养2～7 d后观察滤纸崩溃情况，反映纤维素降解真菌的降解能力[6]。

1.2.4纤维素降解真菌粗酶活的测定。

1.2.4.1粗酶液的制备。吸取发酵液1 ml于10 ml离心管，平衡后于1 000 r/min、4 ℃下离心10 min，上清液即为粗酶液。

1.2.4.2酶活力的测定。采用3，5-二硝基水杨酸法（DNS法），测定总纤维素酶活力滤纸酶活（FPAase）和内切1，4-葡聚糖酶活力（CMCase）。

1.2.4.3CMC酶活力的測定。取1.5 ml羧甲基纤维素钠溶液，加入0.5 ml粗酶液，50 ℃反应30 min后加入1.5 ml DNS试剂，沸水浴5 min，立即冷却，加入1.5 ml蒸馏水，540 nm比色。在上述条件下，1 ml粗酶液在1 min内催化底物生成1 pg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位（U）[7]。

1.2.4.4滤纸酶（FPA）活力的测定。分别称取0.5 g滤纸小孔于试管内，加入柠檬酸缓冲液（pH 5），再加入0.5 ml粗酶液，轻轻摇匀，使滤纸完全浸泡在液体中；在50 ℃温度下保温60 min后，同上采用DNS法测定还原糖[8]。酶活定义同上。酶活通过以下公式计算。

酶活（U）=（OD值×0.724 1×0.039 4）×5×1 00030×0.5

式中，5为定容到的体积，单位为ml；1 000为单位换算；30为反应时间，单位为min；0.5为粗酶液体积，单位为ml。

纤维素酶可将地球上最丰富（占全球总生物量80%）、最廉价的可再生资源纤维素转化为能被直接利用的能源和资源。这是很多科学工作者一直致力研究的方向。然而，纤维素酶的发酵生产及高酶活性的保持一直是生产上难以彻底解决的问题。真菌中的纤维素酶含量较高，活性较强，因此分离纤维素降解真菌，并对其粗酶活性进行研究，能够为纤维素酶液以及获得较高活性纤维素酶提供一定的理论基础和技术支持。

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