兔波氏杆菌病的实验室诊断

邵立岩

兔波氏杆菌病又称为支气管败血波氏杆菌病，引起兔的一种以慢性鼻炎、支气管肺炎及咽炎为特征的呼吸道传染病。

1病原学诊断

1.1细菌培养

样品采集：病兔，将灭菌棉拭子在无菌生理盐水中浸湿，插入病兔鼻腔内，深约10mm，小心转动，蘸取鼻汁；死亡兔或扑杀致死兔，取鼻腔、气管、肺部病变材料用于细菌分离培养。

细菌分离：将附着在棉拭上的黏液涂抹在麦康凯培养基或DHL培养基上，37℃培养48h。肺部病变材料进行培养时，还可用血液琼脂培养基。

结果判定：在改良麦康凯培养基上，支气管败血波氏杆菌菌落直径约1～2mm，圆整、光滑、隆起、透明，略呈茶红色，较大菌落中心厚，呈茶黄色。在DHL琼脂平皿上形成无色半透明，2mm左右菌落。

1.2病原鉴定

生化试验：不发酵碳水化合物，葡萄糖、荒糖、乳糖、甘露醇、果糖木糖呈碱性反应。M.R.试验、靛基质试验、硫化氢产生阴性，V-P试验、枸橼酸盐利用、尿素酶产生、硝酸盐还原、运动力试验阳性。

动物接种试验：常选用幼兔或豚鼠，鼻内接种4h培养物0.1mL，应在几天内出现鼻炎和肺脓肿的典型症状和病理变化。0.5mL剂量耳静脉接种家兔，应于24～48h内死亡。从死亡兔的病变组织及扑杀的活兔的肺脏中均可分离到本菌。

血清平板凝集反应：在清洁的玻片上加一滴阳性血清（约0.3mL），充分混入一铂圈被检菌，轻轻晃动玻片，室温下放置2min。液滴中出现大凝集块或小的粒状凝集物，液体透明，判为阳性。每次试验应设有阴性血清对照和缓冲生理盐水对照。结果判定：液滴中出现大凝集块或小的颗粒状凝集物，液体透明，判为阳性。

免疫荧光检测抗原：应用直接荧光抗体技术，检查鼻甲骨、气管、细支气管及肺脏上皮细胞，观察到颗粒样抗原者判为阳性。该试验一般在感染后7～28天即可检出抗原。

2血清学诊断

2.1凝集反应

将Ⅰ相菌接种到胰蛋白酶大豆肉汤中，37℃培养24～48h，加福尔马林灭活，作为抗原。取凝集抗原与系列稀释的被检血清等量混合，37℃ 2h或56℃ 30min。4℃作用1夜判定。结果为1∶10被检血清呈现明显颗粒状凝集者判为阳性。家兔在感染后2～4周，即可从血清中测出凝集抗体。

2.2免疫扩散试验

抗原制备：将Ⅰ相菌接种在含绵羊鲜血的鲍-姜琼脂培养基上，37℃潮湿温箱中培养36h，向生长良好的Ⅰ相菌培养物中加入缓冲生理盐水，充分振荡后，使菌体分散于溶液中而制成悬液，其菌数为2500亿/mL，再添加福尔马林使其含量为0.37%（甲醛0.15%），摇匀，瓶口加盖胶塞，放置37℃温箱过夜（大约18～20h），次日取出，放室温3～5天，每天振荡3次。以500～1000转/min离心沉淀20min，弃上清液；缓冲盐水洗涤沉淀物，12000～15000转/min离心20min，弃上清液；向沉淀加少量缓冲盐水，按万分之一比例加入硫柳汞防腐。采用辐射免疫扩散法（将其8倍沉淀抗体滴度的抗血清，按10%比例加入到1%琼脂糖Tris缓冲溶液中，制成反应板，然后打孔，室温下湿室作用即可）测定，在反应板上出现直径10mm±1mm明显沉淀者为合格抗原。分装后4℃保存。

阳性血清制造：将上法接种于鲍-姜氏培主基上的Ⅰ相菌用灭菌PBS洗下，记数后加入福尔马林灭活，耳静脉注射3～6月龄的经支气管败血波氏杆菌免疫扩散法检查阴性的健康家兔，每只兔1mL。第一次菌數为100万/mL，以后每周加强免疫1次，每次菌数递增10倍，计6次。最后一次注射后4～5天采血，用免疫扩散法测定抗体滴度在8倍以上为合格，第七周自心脏采血，无菌收集血清。

免疫扩散试验配制：0.7%～1.0%的琼脂糖Tris反应板，按试验方法打孔，并在相应孔中加入抗原或血清。室温下湿室中作用，第二天开始判定，逐日观察记录结果，3天后最后判定。抗原孔与被检血清孔之间形成一条致密的沉淀线并且其末端与毗邻的阳性血清孔与抗原之间的沉淀线相融合者判为阳性，阳性血清与抗原孔之间的沉淀线末端相毗邻的被检血清孔之抗原方向偏弯者亦判为阳性。观察时可借助灯光或自然光源，特别是弱反应须在强烈的日光灯光源照射下才能看清沉淀线。

采用本法检查时，家兔被支气管败血波氏杆菌感染后7～10天即可检出血清抗体，血清中沉淀抗体的存留期在1年以上。本法与细菌分离的符合率在95%左右。