猪圆环病毒病的实验室诊断

李敏 秦立鑫

回顾养猪业30年，传统传染病如猪瘟、口蹄疫、猪丹毒等得到有效控制，而一些新发疾病蓝耳病、副猪嗜血杆菌病、圆环病毒病等持续暴发，单一病原感染向多种疾病混合感染发展，疫病防控与诊断难度增加。圆环病毒病侵害猪的免疫系统、造成免疫抑制，打开了其他疾病入侵的门户，对于这种疾病早期诊断确诊、早期有效治疗尤为重要。由于疾病复杂程度增高、兽医仅凭临床表现和病理解剖难以全面把握，文章综述猪圆环病毒病常用实验室诊断方法，分析各种方法学优、略势。

1 圆环病毒概述

猪圆环病毒（porcine circovirus， PCV）属于单股DNA圆环病毒科圆环病毒属成员，二十面体结构、无囊膜、由衣壳蛋白和DNA组成，为已知的最小动物病毒之一，分为I型（PCVl）和II型（PCV2）两个型。PCV1基因大小为1759hp，PCV2分为两个基因型、大小分别为1767-1768hp，PCV1和PCV2两种基因型在核苷酸序列上相似度低于80%、但抗原之间仍存在交叉反应。PCV1最早在1974年发现、被证明没有致病性；PCV2于1997年被分离出来，可引起了淋巴细胞凋亡、APC递呈抗原能力的减弱、同时降低了B细胞和CD4+T细胞的机能。PCV2具有免疫抑制性，感染PCV2的猪一般都发生免疫缺陷，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症、新生仔猪先天性震颤、猪皮炎肾炎综合症、呼吸系统综合症、母猪繁殖障碍等。

2 病原学诊断

2.1 病毒的分离与鉴定

圆环病毒传播主要以粪口途径为主，病毒先定居于扁桃体、之后随血液遍布全身淋巴结及各个器官组织，可取病死猪的脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结等作为病原的分离材料。将取材进行研磨离心、氯仿抽提，接种于PK15细胞。PK15为猪肾细胞，圆环病毒可在PK15细胞上良好生长而不产生细胞病变，培养过程中可加入D-氨基葡萄糖能够促进病毒的增殖，细胞培养进行传代1～3次后应进行PCV2抗原或核酸的检测加以鉴定。

2.2 问接免疫荧光法

间接免疫荧光实验是检测病毒的常用方法之一，通常以薄片作为载体、固定组织或细胞、再加入待检标本和荧光标记物、在荧光显微镜下观察结果。Allan等利用间接免疫荧光法来检测圆环病毒II型，取病死猪的肺脏、淋巴结、肾脏等组织病料研磨离心处理后以盖玻片为载体在PK15细胞上培养，丙酮固定，用荧光素标记的兔抗高免血清与细胞培养物中的PCV2抗原反应，荧光显微镜下观察结果，可对PCV2进行检测和分型。该方法对实验室设备及操作人员技术要求较高，专业实验室可操作、基层较难开展。

2.3 PCR

目前应用于PCV检测的PCR实验方法主要包括常规PCR方法、多重PCR方法、巢式PCR方法等。在PCR仪中热稳定的DNA聚合酶可使短链的双股靶DNA很快地复制成千上万倍，可以使DNA数量急剧增长而达到检测极限。理论上，可在2h内将一个DNA分子扩增到106～109倍，从而大大提高了对其进行分析研究的速度。吕艳丽等根据PCV的基因序列设计一对特异的PCR引物进行PCV检测，建立了特异的PCV诊断方法，该方法可以检测细胞和组织中的病毒核酸。王忠田等利用PCR技术对发病的规模化猪场进行了PCV感染的调查，同时利用该方法研究了PCV病毒在自然感染猪体内的分布情况。多重PCR是一种特殊的PCR检测方法，可同时检测多种病毒DNA，即在同一反应体系中加入不同病毒引物、扩增不同的目标片段，例如圆环病毒一伪狂犬病毒一细小病毒三联检。

3 血清学诊断

人工感染试验证明，由PCV2引起的血清转换发生于感染后14～28d，所以抗体检测有一段时间的窗口期。另外，PCV1和PCV2之间存在抗原交叉反应，所以制备针对PCV2的单克隆抗体是血清学鉴定的前提条件。

3.1 间接免疫荧光

将PCV2抗原与荧光素（异硫氰酸）进行结合，制备出荧光素标记抗原，在反应板上加入待检标本，如存在PCV2抗体则产生抗原抗体复合物，在荧光显微镜下可观察。如有待见卢银华等用猪肾传代细胞系PK-15增殖猪圆环病毒2型（PCV2）毒株制备抗原，建立了检测PCV抗体的间接免疫荧光试验（IFA）。应用该方法对64份临床送检血清样品进行了检测。结果38份血清呈现PCV抗体阳性（59%）。但间接免疫荧光实验方法对操作技术要求高、需要专门的荧光显微镜、需要有有经验的检测人員、缺乏标准化的商业试剂盒，因此该方法的大范围临床应用受到了限制。

3.2 乳胶凝集实验（LAT）

将PCV病毒致敏乳胶颗粒，制备成诊断抗原，取血清或全血标本，可在现场圈舍旁边检测抗体，主要是检测IgM，使用于感染早期诊断。该实验方法操作容易、实验条件简单、3～5min出现结果、肉眼判断、不需要专门培训、价格低廉、适于现场检测，在临床检验中被广泛应用。

3.3 ELISA

将病毒、纯化的蛋白质等抗原包被在酶联板上，通过间接法、竞争法等程序检测抗体。检测方法具有诊断速度快，敏感性高，特异性强等优点，适合大规模检测的要求。有人用PCV2抗原包被96孔酶标板，PCV2单克隆抗体作为酶结合物，采用竞争法检测PCV2抗体。该实验与传统的间接免疫荧光发相比较检测同样标本，ELISA法敏感性达到99.6%，而间接免疫荧光法只有97%。张志慧等对市场上5种ELISA试剂盒性能做了苹果，发现差异较大。分析为各试剂盒原料、工艺有较大差异，方法学有竞争法有夹心法、原料上有基因合成的PCV2-cap、有重组的PCV2-cap，酶标抗体有单克隆抗体有多克隆抗体。

中国兽药监察所对上市的几种抗体检测试剂做了评估，发现特异性均达到87%以上，但敏感性从58%到100%不等。