2010～2014年小麦遗传转化文献分析

刘涛 周正剑 王萍 成雄鹰

摘要 自从1992年第一株转基因小麦诞生以来，小麦的转基因技术经有了很大的发展。该研究分析了Web of knowledge数据库和CNKI数据库收录的2010～2014年发表的关于普通小麦转基因的文献。筛选得到102篇英文文献和103篇中文文献，涉及296个试验，共对152个普通小麦品种进行了遗传转化研究。目前小麦遗传转化主要采用基因枪和农杆菌介导法，分别占总试验数的68.25%和30.4%；少数试验使用花粉管通道和电转化进行转基因。转化靶标组织主要是幼胚及其愈伤组织，占试验总数的80.35%；其次为成熟胚来源的愈伤组织，占8.62%。Bar、HPT、NPTII、PMI和AtMYB12分别在不同的试验中被使用，但Bar是最常用的筛选标记，占试验总数的61.22%。不同试验的转化率相差较大，从0.1%到45%不等。

关键词 小麦；转化体系；文献分析

中图分类号 S126 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）34-345-05

小麦是世界上主要的粮食作物之一，2013年全球小麦产量7.15亿t，仅次于玉米（10.18亿t）和水稻（7.4亿t）。然而小麦的生产受到多方面的威胁，分析2004～2013的全球小麦单产，发现小麦单产不稳定，且增幅较小。最低单产是2007年的2 828.08 kg/hm2，最高的是2013年的3 268.30 kg/hm2。我国已成为世界上最大的小麦生产国，2013年我国小麦产量占世界产量的17.03%。2010～2014年，我国小麦产量增速减缓，平均年增长率仅为1.5%[1]。鉴于目前人口的持续增长和耕地的不断减少。有必要采用多种措施稳定或增加产量。

植物转基因技术是利用现代生物技术的方法，将有利基因导入受体植物的基因组中，产生有附加值的性状。近年来，转基因产品在大豆、玉米和棉花上取得巨大的成功，创造了良好的经济和社会效益。作为世界3大粮食作物之一，小麦的转基因研究滞后于水稻和玉米，直到1992年才有Vasil利用基因枪法获得世界上第一株转基因小麦[2]。但至今小麦的遗传转化率仍较低，容易导致插入沉默，且表现出很强的品种依赖性[3]。但随着技术的发展，新的遗传改良工具CRISPRCas[4]和TALEN[5]等技术的发展，为高效的植物改良提供了新的途径。而且这些技术的应用都需要通过遗传转化技术来实现。

在Web of knowledge数据库是由汤森路透（Thomson Reuters）开发维护的全球最大的生命科学数据库，包括2 000多种来自世界各地的期刊[6]。CNKI是我国最大的文献数据库，覆盖96%的中文期刊[7]。笔者搜集整理了2010～2014年Web of knowledge数据库和CNKI的文献数据库收录的关于普通小麦转基因的文献，系统地分析以往的小麦遗传转化研究，旨在更全面地了解小麦遗传转化的过程和现状，比较不同实验技术的优缺点，为进一步提高小麦遗传转化效率提供新的思路。

1 研究方法与数据来源

1.1 文献收集方法

在Web of knowledge数据库中，首先使用“Year Published=（2010-2014）Timespan=All years Search language=English”搜索组合搜索统计文献数目；再使用“Topic=（transgenic）AND Year Published=（2010-2014）Timespan=All years.Search language=English”搜索组合搜索统计文献数目；然后使用“Topic=（wheat）AND Topic=（transgenic）AND Year Published=（2010-2014）Refined by：Databases=（BCI OR WOS OR MEDLINE）Timespan=All years.Search language=English”搜索組合进行搜索，统计文献数目；在CNKI的文献数据库（http：//epub.cnki.net/）首先使用发表时间20100101～20150101，进行搜索，统计文献数目。再使用关键词“转基因”，范围选择为主题+发表时间为20100101～20150101，进行搜索，统计文献数目。使用关键词“转基因”和“小麦”，范围选择为“主题”+发表时间为20100101～20150101进行搜索，统计文献数目。使用同样的方法对玉米和水稻的文献状况进行搜索，只统计文献数目，不进行人工判读。同时使用CNKI的成果数据库（http：//epub.cnki.net/kns/brief/result.aspx？dbPrefix=SNAD）、CIMMYT的wheat atlas数据库（http：//wheatatlas.cimmyt.org/）和USDA的GRIN数据库（http：//www.arsgrin.gov/）获得文献中使用小麦品种的详细信息。

1.2 文献的筛选和信息收集

对搜索出的文献进行人工判读，排除摘要、重复文章、会议文章、综述文章和以非普通小麦为受体的文章。收集筛选出的文献的下列试验信息：受体品种、外植体、转基因方法、筛选基因和转基因效率。其中外植体主要分为幼胚和成熟胚2类：转化受体为幼胚和幼胚诱导的愈伤都被归为幼胚类；受体为成熟胚和成熟胚诱导的愈伤归为成熟胚类。转基因效率=阳性植株/侵染受体数目。

2 结果与分析

2.1 小麦转基因研究的活跃度

对上述搜索条件下获取的文献数目进行分析，用相关作物文献所占的比例来表示该作物转基因研究的活跃度，结果见表1。由表1可知，在Web of knowledge数据库中，水稻转基因的文献数目是小麦转基因文献数目的5.86倍。玉米转基因文献数目是小麦转基因文献数目的1.88倍。在CNKI数据库中同样发现，水稻转基因的文献数目是小麦转基因文献数目的2.98倍，玉米转基因文献数目是小麦转基因文献数目的2.18倍。说明在这3种作物中，水稻转基因研究最活跃，玉米转基因研究次之，小麦转基因研究最少。

2.2 受体品种

小麦按低温春化时间长短，可分为春性小麦和冬性小麦。按播种时间可分为春小麦和冬小麦。春小麦一般是春性小麦，而冬小麦可能是春性小麦或冬性小麦[8]。春性品种小麦被选为受体材料的比例远大于（3∶1）非春性品种。春性小麦不需要低温春化即可抽穗结实，可以春播，生育期短。而冬性品种因需要低温春化才可抽穗结实，必须秋播或人工春化，生育期较长。例如春性品种“陇春23”在甘肃省春播，生育期只有100 d[9]，而半冬性品种“周麦16”在河南省秋播，生育期为236 d[10]。因此春性小麦在幼胚供应、培养周期和转基因苗结实率3个方面具有明显的优势。

在Web of knowledge数据库中检索到921篇文献，经筛选得到103篇英文文献，信息收集结果如表2。103篇文献涉及137个转化试验，共用了68个普通小麦品种。137个试验中，41个试验采用品种Bobwhite，占试验总数29.93%。CNKI数据库中检索到834篇文献中，经筛选103篇中文文献符合要求。信息收集结果如表3。103篇文献涉及157个转化试验，对84个普通小麦品种进行了转化。157个试验中，25个使用扬麦系列品种做为受体材料，占实验总数15.92%。小麦品种按生态类型进行分类，Web of knowledge数据库收集的139个试验中有103个试验的受体品种确定了生态类型，其中使用春性品种的有94个，占试验总数的91.26%。CNKI数据库收集的157个试验中，130个试验所采用的品种确定了生态类型。其中82个试验使用了春性品种，占试验总数的63.08% 。总共233个转基因试验中有176个使用了春性品种，占试验总数的75.54%。

英文文献试验中使用频率最高的Bobwhite为墨西哥春性小麦品种。CIMMYT研究了129个Bobwhite姐妹系的转化效率。其中Bobwhite SH9826获得了73.81%的转化效率，在所见文献中最高[11]。但品种Bobwhite的农艺性状较差，影响转基因技术的直接应用[12]。中文文献中使用最多的小麦品种为扬麦系列。张月婷等[13]使用品种“扬麦158”的幼胚为外植体，经过农杆菌介导、Bar基因筛选，获得了2.33%的转化效率。在总共178个试验中有28.65%选择了这2个系列的品种，可以推测它们在目前的转化体系下的转化效率是稳定的。

Terese Richardson等[14]用同样的转化方法对10个小麦品种的进行转化，比较转化率发现，差异巨大，最高的转化率为45%，最低为0。Pellegrineschi等[11]研究了129个Bobwhite姐妹系的转化效率，得到了类似的结论，转化率的分布从0到73.81%。由此可以看出小麦转化表现出很强的品种依赖性。表明转化效率在一定程度上受品种的遗传特性影响。

2.3 外植体

由图1可知，Web of knowledge数据库收集的137个试验，使用了3种外植体，分别为幼胚、成熟胚、生长点。117个试验采用幼胚为外植体，占试验总数的85.40%。13个试验选用成熟胚为外植体，占试验总数的9.49%。CNKI数据库收集的157个试验，使用了4种外植体，分别为幼胚、幼穗、成熟胚和生长点。114个试验以幼胚为外植体，占试验总数的72.61%。12个试验以成熟胚为外植体，占试验总数的7.64%。25个试验采用生长点为外植体，占试验总数的15.92%。

高通量的转化体系要求外植体具有稳定高效的再生能力，一般不应低于80%，且以丛生芽再生植株形式为宜[15]。幼胚是目前使用频率最高的外植体，且获得的转化率也最高。一般选取开花后12～14 d左右的幼胚，大小为0.5～1.5 mm[16-22]。但幼胚的供应受时间限制且幼胚的状态也很难控制，造成以幼胚为外植体的转化实验的重复性差。成熟胚则没有以上问题，种子可以方便的保存在实验室内，随时使用且质量均一，试验重复性好[23-24]。但成熟胚的再生能力不如幼胚。近些年在有许多学者对成熟胚的再生能力进行研究。Moghaieb等[25]使用小麦品种“Gemmiza10”和“Gemmiza9”的成熟胚进行农杆菌转化试验，获得了95%和87.5%的再生频率，最终的转化率为8.8%和6.9%[25]。Raja等[26]使用小麦品种“Tartara2002”的成熟胚进行农杆菌转化试验，获得了40%的转化效率。我国学者张东武等[27]使用品种“西农928”的成熟胚为外植体，通过基因枪介导转化，以Bar基因为筛选标记，获得了1.2%的转化效率。Ding等[28]使用“鄂麦12”的成熟胚为外植体，用农杆菌介导转化，以Bar基因为筛选标记，获得了1.52%的转化效率。生长点和幼穗是植物生长分化的活跃部位，利用农杆菌对这些部位进行活体侵染，在后代可得到阳性转化苗[29-30]。生长点和幼穗为外植体进行转化有明显的优势，主要包括不依赖于组织培养、不受基因型限制、操作方便，不受设备限制；同时劣势也十分明显，转化率低、容易产生嵌合体和转化体系不成熟，限制了这些外植体的使用[31]。

2.4 转化方法

由图2可知，Web of knowledge數据库收集的137个试验，使用了3种方法介导小麦转基因，分别为基因枪介导法、农杆菌介导法和花粉管通道法。91个试验采用基因枪介导法进行转基因，占试验总数的66.42%。45个试验使用农杆菌介导法完成基因导入，占总数的32.85%。CNKI数据库收集的157个试验使用了4种转化方法（基因枪介导法、农杆菌介导法、花粉管通道法和电转化法）。111个试验应用基因枪介导法，占总试验数的70.7%。43个试验采用农杆菌介导法，占试验总数的27.39%。

可以看出，目前小麦转基因主要使用基因枪和农杆菌介导法。在总共294个试验中，68.7%采用基因枪介导，31.29%使用农杆菌介导完成转化。从转化效率上看，基因枪法目前最高获得73.81%的转化率[11]。农杆菌法最高获得41.00%的转化率[14]。Hu等[18]比较了基因枪法和农杆菌法的转化质量，发现农杆菌法得到的低拷贝的转化事件优于基因枪法。Sparks使用同一个转化系统，基因枪介导可以实现了35个小麦品种的转化。而农杆菌介导只有少数几个品种获得了转基因植株[32]，推测原因是小麦品种对农杆菌不敏感。Li等[33]研究发现与基因枪法比较，农杆菌介导的转化事件能在后代中稳定的遗传表达，不会出现基因沉默的现象。

花粉管通道技术是利用作物授粉后所形成的天然花粉管通道（又称花粉管引道组织）经珠心通道将 外源 DNA 携带入胚囊，转化受精卵和其前后的生殖细胞（精子、 卵子），由于它们仍处于未形成细胞壁的类似 “原生质体” 状态，并且正在进行活跃的 DNA 复制、分离和重组，所以很容易将外源 DNA 的片段整合到受体基因组中，达到遗传转化的目的[34]。该法操作简单，易于推广，不受基因型限制，但转化机理不清晰，受环境影响大，转化效率低[35]。

2.5 筛选标记

由图3可知，Web of knowledge数据库收集的137个试验，使用了5种筛选标记，分别为Bar、HPT、NPTII、PMI和AtMYB12。Bar基因使用最为普遍，占试验总数的59.12%。HPT基因和NPTII基因次之，分别占试验总数的10.22%和14.60%。AtMYB12是一种可视的报告基因，是黄酮醇生物合成专一性的激活因子。AtMYB12导入小麦中，提高小麦黄酮和花甘色素的含量。花甘色素的大量表达能够使小麦表现出红色或紫色[36]。CNKI数据库收集的157个试验也采用了上述5种筛选标记。Bar基因被97个试验采用，占试验总数的61.78%。NPTII基因在25个试验中出现，占试验总数的15.92%。

图3 CNKI和Web of science数据库中使用各种筛选基因的频数分布

Vasil等[2]获得第一株转基因小麦，使用的筛选标记是Bar基因。此后Bar基因在小麦转化中被广泛利用。在此次收集到的294个试验中，180个试验使用Bar基因为筛选标记，占试验总数的61.22%。2002年Pellegrineschi等[11]使用Bobwhite的幼胚为外植体，用基因枪介导，以Bar基因为筛选标记，获得了73.81%转化效率，在所见文献中最高。2003年Hu等[18]采用Bobwhite的幼胚为外植体，农杆菌介导，EPSPS基因为筛选标记，获得了4.4%的转化效率，说明EPSPS在小麦中也可应用[37]。

2012年Agnieszka Bińka等[38]在2个小麦品种“Kontesa”和“Torka”对比了Bar和NptII 2种筛选标记的效率，发现在这2个小麦品种中，以NptII为筛选标记的转化体系的转化率显著大于以Bar为筛选标记的转化体系的转化率[38]。由此可以看出转化率和筛选标记之间存在关系，选择合适的筛选标记，可以提高转化效率。

2.6 转化效率

Web of knowledge數据库收集的137个试验中有50个提供了转化效率，最小的转化效率为0.28%，最大的为45%，中位数是2.1%。最大的转化效率来源于Richardson等[14]，试验采用小麦品种Westonia的成熟胚为外植体，诱导愈伤组织。使用农杆菌（AGL1）介导进行遗传转化，bar为筛选基因。CNKI数据库收集的157个试验中有100个提供了转化效率，其中最小的为0.1%，最大的为34.8%，中位数为0.66%。王维[30]采用农杆菌（EHA105）将水稻OsDREB2.1基因导入小麦品种周麦16和冀麦38的幼穗中，获得了34.8%的转化效率。蔡琳[39]使用基因枪介导法，以小麦品种陇春23的幼胚为外植体，Bar基因为筛选基因，获得了15.88%的转化效率。值得一提的是，在所有提供转化效率的试验中，75.33%转化率低于3%。

3 结论

文献分析结果表明，农杆菌和基因枪法能有效地转化小麦，Bar基因是可靠的筛选标记，受体材料受基因型限制明显。受体组织主要依赖于幼胚，但有些基因型的成熟胚转化成功，说明在小麦遗传转化中成熟胚有进一步利用的潜力。

参考文献

[1] [1] FAO.FAO Statistics[EB/OL].[2015-02-12].http：//www.fao.org/statistics/en/.

[2] VASIL V，CASTILLO A M，FROMM M E，et al.Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile[J].Nature Biotechnology，1992，10：667-674.

[3] 喻修道，徐兆师，陈明，等.小麦转基因技术研究及其应用[J].中国农业科学，2010，43（8）：1539-1553.

[4] UPADHYAY S K，KUMAR J，ALOK A，et al.RNAguided genome editing for target gene mutations in wheat[J].Genomes genetics，2013，3（12）：2233-2238.

[5] WANG Y，CHENG X，SHAN Q，et al.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew[J].Nat Biotechnol，2014，32：947-951.

[6] Reuters T. Web of Science Core Collection[EB/OL].[2015-02-12]. http：//thomsonreuters.com/web-of-knowledge/.

[7] CNKI.中国学术期刊网络出版总库[DB/OL].[2015-02-12]. http：//cnki.hznet.com.cn/kns55/brief/result.aspx.

[8] 曹新有，刘建军，程敦公，等.小麦品种冬春性、抗寒性与广适性的关系[J].麦类作物学报，2012，32（6）：1210-1214.

[9] 袁俊秀，杨文雄.丰产广适优质春小麦新品种：陇春23号[J].麦类作物学报，2009（4）：740.

[10] 殷贵鸿，韩玉林，黄峰，等.小麦新品种周麦16的选育及其特征特性[J].作物杂志，2005（2）：54.

[11] PELLEGRINESCHI A，NOGUERA L M，SKOVMAND B，et al.Identification of highly transformable wheat genotypes for mass production of fertile transgenic plants[J].Genome，2002，45（2）：421-430.

[12] PREZPIEIRO P，GAGO J，LANDN M，et al.Agrobacteriummediated transformation of wheat：general overview and new approaches to model and identify the key factors involved[M]//IFTI .Transgenic plantsAdvances and limitations.Agricultural and Biological Sciences，2012.

[13] 張月婷，廖玉才，黄涛，等.农杆菌介导的小麦转化体系的优化[J].华中农业大学学报，2012（1）：23-27.

[14] RICHARDSON T，THISTLETON J，HIGGINS T J，et al.Efficient Agrobacterium transformation of elite wheat germplasm without selection[J].Plant cell，tissue and organ culture，2014，119（3）：647-659.

[15] 谢丛华，柳俊.植物细胞工程[M].2版.北京：高等教育出版社，2004.

[16] CHENG M，FRY J E，PANG S，et al.Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].Plant physiology，1997，115（3）：971-980.

[17] MELCHIORRE M N，LASCANO H R，TRIPPI V S.Transgenic wheat plants resistant to herbicide BASTA obtained by microprojectile bombardment[J].Biocell，2002，26（2）：217-223.

[18] HU T，METZ S，CHAY C，et al.Agrobacteriummediated largescale transformation of wheat（Triticum aestivum L.）using glyphosate selection[J].Plant cell reports，2003，21（10）：1010-1019.

[19] PRZETAKIEWICZ A，KARAS A，ORCZYK W，et al.Agrobacteriummediated transformation of polyploid cereals.The efficiency of selection and transgene expression in wheat[J].Cellular & molecular biology letters，2004，9（4B）：903-917.

[20] MACKINTOSH C A，GARVIN D F，RADMER L E，et al.A model wheat cultivar for transformation to improve resistance to Fusarium Head Blight[J].Plant cell reports，2006，25（4）：313-319.

[21] PELLEGRINESCHI A，NOGUERA L M，SKOVMAND B，et al.Identification of highly transformable wheat genotypes for mass production of fertile transgenic plants[J].Genome，2002，45（2）：421-430.

[22] HENSEL G，KASTNER C，OLESZCZUK S，et al.Agrobacteriummediated gene transfer to cereal crop plants：Current protocols for barley，wheat，triticale，and maize[J].International journal of plant genomics，2009，2009：835608.

[23] YE X G，WANG D W，TAO L L，et al.Transgenic wheat plants derived from Agrobacterium mediated transformation of mature embryo tissues[J].Cereal research communications，2009，37（1）：1-12.

[24] PATNAIK D，KHURANA P.Genetic transformation of Indian bread（T.aestivum）and pasta（T.durum）wheat by particle bombardment of mature embryoderived calli[J].BMC plant biology，2003，3：5.

[25] MOGHAIEB R E，ELARABI N I，MOMTAZ O A，et al.Genetic transformation of mature embryos of bread（T.aestivum）and pasta（T.durum）wheat genotypes[J].GM crops，2010，1（2）：87-93.

[26] RAJA N I A B，BANO A，RASHID H，et al.Improving agrobacterium mediated transformation protocol for integration of XA21 gene in wheat（Triticum aestivum L.）[J].Pakistan journal of botany，2010，42（5）：3613-3631.

[27] 張东武，刘辉，赵惠贤.小麦成熟胚组织培养再生体系的优化及高再生率基因型的筛选[J].麦类作物学报，2011（5）：847-852.

[28] DING L，LI S，GAO J，et al.Optimization of Agrobacteriummediated transformation conditions in mature embryos of elite wheat[J].Molecular biology reports，2009，36（1）：29-36.

[29] He C M，ZHANG W W，GAO Q，et al.Enhancement of drought resistance and biomass by increasing the amount of glycine betaine in wheat seedlings[J].Euphytica，2011，177（2）：151-167.

[30] 王维.利用农杆菌介导的幼穗法将水稻OsDREB2.2基因导入小麦的研究[D].保定：河北农业大学，2012.

[31] 叶兴国，陈明，杜丽璞，等.小麦转基因方法及其评述[J].遗传，2011（5）：422-430.

[32] SPARKS C A，JONES H D.Biolistics transformation of wheat[J].Methods in molecular biology，2009，478：71-92.

[33] LI J R，YE X G，AN B Y，et al.Genetic transformation of wheat：Current status and future prospects[J].Plant biotechnology reports 2012，6（3）：183-193.

[34] 李志亮，吴忠义，杨清，等.花粉管通道法在玉米基因工程改良中的应用[J].玉米科学，2010（4）：71-73，76.

[35] 简纯平，李开绵，欧文军.花粉管通道法转基因育种研究进展[J].热带作物学报，2012（5）：956-961.

[36] GAO X，ZHANG L，ZHOU S，et al.AtMYB12 gene：A novel visible marker for wheat transformation[J].Molecular biology reports，2011，38（1）：183-190.

[37] Center for Environmental Risk Assessment.MON71800[EB/OL].[2015-02-12].http：//www.cera-gmc.org/action=gm_crop_database&mode=ShowProd&data=MON71800.

[38] BINKA A，ORCZYK W，NADOLSKAORCZYK A.The Agrobacteriummediated transformation of common wheat（Triticum aestivum L.）and triticale（x Triticosecale Wittmack）：Role of the binary vector system and selection cassettes[J].Journal of applied genetics，2012，53（1）：1-8.

[39] 蔡琳.小麦组织培养体系优化及抗冻基因KN2转化小麦的研究[D].武汉：华中农业大学，2011.