发酵型海带酒的研制及其抗氧化性的研究

陈美龄 金芳园 邓尚贵

摘要[目的]研制发酵型海带酒，提高海带的综合利用率。[方法] 以海带提取液为研究对象，用3种发酵剂及其两两混合对海带提取液进行发酵制酒，采用定量描述分析（QDA）對海带酒进行感官评定，筛选出最优发酵剂，然后通过正交试验对海带提取液工艺进行优化，最后测定发酵酒的抗氧化性。[结果]试验表明，海带本身携带的自然菌群对发酵酒的品质没有显著的影响；最佳发酵剂为混合菌（安琪提供的酿酒曲和葡萄酒果酒专用酵母SY）。海带提取液的最佳工艺参数为提取温度90 ℃、浸泡时间3 h、料液比1∶20 g/ml。6种不同的菌种后发酵25 d的发酵酒的抗氧化性都较高。[结论] 研究可提高海带的附加值，为海带资源的开发利用开辟新的途径。

关键词海带；发酵酒；酵母菌；抗氧化性

中图分类号S986.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）34-078-03

海带作为一种天然传统食品，营养价值很高。海带中的碳水化合物含量高于普通蔬菜好几倍，其中的海带多糖含量较高，目前己发现褐藻糖胶、褐藻淀粉及岩藻聚糖硫酸酯3种多糖。海带中纤维、蛋白含量也很高，且必需氨基酸的模式符合联合国粮食及农业组织（FAO）标准模式。海带同时也含有丰富的矿物质和维生素，且脂肪酸为不饱和脂肪酸居多。

海带不仅有着丰富的营养物质，而且药用价值也较高。近年来，海藻中的次生代谢物质，如萜类、甾醇类、大环内酯类和酚类等已成为研究的热点，特别是多酚类物质因其所具有的抗氧化特性而备受瞩目[1-3]。最近几年，科学家们研究发现，对于癌症的治疗和预防，海带也有着重要的作用[4]。

但我国对海带资源的开发利用还非常有限。海带酒是海带的一种深加工产品，可提高海带的附加值，为海带资源的利用开辟新途径。海带发酵酒的研究已有少数中文报道，外文还未见报道。刘秀河等报道了海带汁的提取、酶解、酸解条件及发酵的最佳工艺研究[5]；王克明报道了多元混菌固定化发酵海藻保健酒的制备工艺优化的研究[6]；田宝兰报道了海带酒制作工艺、海带酒在发酵过程中功能性成分含量的变化及海带酒的澄清及稳定性的研究[7]。

笔者以海带提取液为研究对象，用3种发酵剂及其两两混合对海带提取液进行发酵制酒，并对不同菌种发酵的海带酒进行抗氧化性的初步研究。

1材料与方法

1.1材料

海带干货和蔗糖，浙江舟山华之友超市提供，阴凉干燥处保存；

由安琪酵母股份有限公司提供的发酵菌，

①酿酒曲配料为：酵母、根霉α淀粉酶、葡糖淀粉酶、植物酶；

②甜酒曲配料为：根霉菌、米粉；

③葡萄酒果酒专用酵母SY 配料为：酵母、乳化剂；

其他化学试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

主要仪器：

HH4型电热恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；

BS110S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；

UV2800紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；

LD2X40BI型立式电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；

HWS270恒温恒湿培养箱，宁波东北仪器有限公司；

UPKII60L超纯水机，成都优普超纯科技有限公司。

1.2方法

1.2.1海带酒的发酵制备。

发酵菌株是发酵酒酿造的重要因素，对酒的感官特性有很大的影响。因此，选择优良的发酵剂是海带酒发酵的重要环节。海带本身携带的自然菌群也会参与发酵过程，为了考察海带本身携带的自然菌群对海带发酵酒的影响，该试验分别以灭菌后的海带提取液和不灭菌的海带提取液为原料，接种6种发酵剂进行海带酒的制备，并对其成品海带酒进行感官评定，分析海带本身携带的自然菌群对海带酒的影响，并筛选出最优的发酵剂。

1.2.1.1海带提取液的制备。干制海带→剪碎→不彻底清洗（干制海带表面的白色附着物的有效成分为甘露醇，彻底清洗后会使其流失）→加水浸泡（1∶25 g/ml）→捣碎机再次捣碎→加水至1 000 ml→90 ℃水浴锅水浴4 h（期间要不断搅拌）。

1.2.1.2发酵。将200 ml海带提取液倒入250 ml的锥形瓶中，在高压灭菌锅中121 ℃，20 min灭菌，冷却到室温后分别接种6组发酵剂，每组3个平行，依次为果酒曲、甜酒曲、酿酒曲、甜酒曲和酿酒曲的混合菌种、果酒曲和酿酒曲的混合菌种、甜酒曲和果酒曲的混和菌种，然后依次加入5%的蔗糖提供外源碳源，放置于 37 ℃的生化培养箱中进行主发酵。主发酵5 d结束后放置于4 ℃冰箱进行后发酵。此次试验后发酵15 d后对其进行感官评定（将3个平行组同时倒入一个容器中，混匀）。用不灭菌的海带提取液为原料进行相同的操作。

1.2.2感官评定试验方法。

1.2.2.1感官评定方法。

由经过感官品评训练的12名品评员组成评定小组，对海带发酵酒的感官特性指标逐项进行打分。全部品评员评价结束后，收集每个品评员的评价结果，进行数据分析，采用QDA图表示[8]。

1.2.2.2评分标尺的建立。

数字标尺可以在感官检验中量化品评结果，包括运用在感官、态度、喜好性等感官评价中。该试验采用9点的数字标度为评分标尺，由1、2、3、4、5、6、7、8、9这9个数字把感官特性的强度由弱到强划分，以此建立海带发酵酒的感官分析评分尺度表。

1.2.2.3描述词汇表的建立。

感官品评员对各自的海带酒样品进行品评，然后记录并讨论出能反映海带发酵酒产品的色泽、澄清度、酒味、海带味、甜味、风格感官特性的6个词汇作为定量描述分析法的描述词汇，并给出词汇的定义。其中第6个词汇的品评结果很大程度上受到前5个词汇结果的影响。

1.2.3海带提取液参数优化正交试验。

海带提取液是影响海带发酵酒品质的一个关键因素，故在这个试验中主要是对海带提取液的工艺参数的优化。

正交试验：在选出最佳发酵剂的前提下，优化原料海带提取液的提取工艺参数，以感官评定的结果为指标，确定最佳料液比、浸提时间及水浴温度。其因素与水平见表1。

表1海带提取液提取的因素与水平

水平因素浸提温度（A）∥℃浸提时间（B）∥h料液比（C）∥g/ml

15011∶20

27031∶25

39051∶30

1.2.4海带酒抗氧化性的测定。

1.2.4.1清除 DPPH 自由基的能力测定[9]。

称取海带提取液 1 ml及1×10-4 mol/L DPPH 溶液1 ml 加入同一试管中摇匀后，在室温下密闭静置30 min，对照组1为1 ml 95%的乙醇和1 ml的样品，对照组2为1 ml的蒸馏水和1 ml的DPPH，其他步骤一样。于 535 nm波长下测定吸光度。依次记为A1、A2、A3 。调零组为95%的乙醇，根据下列公式计算每种提取液对 DPPH 自由基的清除率。

清除率=[A3-（A1-A2 ）/A3]×100%

1.2.4.2清除羟自由基的能力测定[9]。

取浓度为 0.75 mmol/L 邻二氮菲溶液 1 ml于试管中，依次加入 0.20 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.4）2 ml、蒸馏水1 ml，混合均匀，加入浓度为 0.75 mmol/L 的 硫酸亚铁溶液1 ml，混匀，加入1 ml的0.12%的 H2O2，37 ℃水浴 90 min，于波长536 nm 处测其吸光度Ap；其余条件相同，用 1 ml 蒸馏水代替 1 ml H2O2 为Ab ；用样品溶液代替1 ml 的蒸馏水为As。

样品对羟自由基清除率=（As-Ap ）/（Ab-Ap ）×100%

1.2.4.3超氧阴离子自由基体系[10]。

取pH 8.2的TrisHCl缓冲液5 ml，分别加入0.25 ml 试样和0.10 ml 邻苯三酚溶液，混匀后于25 ℃水浴中反应15 min，后使用1 cm的比色皿，以蒸馏水做空白对照，在波长320 nm处时测吸光度Ai，并测定本底扣除水解自身的干扰，计算清除率。

清除率的计算公式：

超氧阴离子自由基清除率（% ）=A0[（Ai-Aj）/A0]×100%

式中，A0 为空白的平均吸光度，Ai为试样的吸光度值，Aj为样液本底的吸光度值。

2结果与分析

2.1海带本身携带的自然菌群对发酵的影响及菌种的优选

以灭菌后的海带提取液为原料，接种6种发酵剂制备海带酒，对这6种海带酒进行感官评定，其感官评定QDA图如图1、2所示。

注：图中的酿+果=酿酒曲+果酒曲；酿+甜=酿酒曲+甜酒曲；果+甜=果酒曲+甜酒曲。

图1不同菌种发酵的海带酒（灭菌）感官特性QDA图

注：图中的酿+果=酿酒曲+果酒曲；酿+甜=酿酒曲+甜酒曲；果+甜=果酒曲+甜酒曲。

图2不同菌种发酵的海带酒（不灭菌）感官特性QDA图

由图1和图2可以看出，海带提取液灭菌与不灭菌最后发酵得到的海带酒的澄清度是有明显差距的，而其他感官指标都是比较相近的，总体的风味相差较小，可知海带本身携带的菌种对试验没有明显的影响，因此后续试验均以不灭菌的海带提取液为原料进行发酵试验。试验总体平均值都在4～7，说明各感官评定最后的评分结果都不是很大，处于适中。从图1和图2的第6个综合因素风格的得分，可以较明显地得出最优发酵菌为酿酒曲和果酒曲的混合菌种。图1各组试验在澄清度上显著高于图2得分，分析其原因可能是：在海带提取的过程中有部分的胶类物质被提出，但是经过高温高压灭菌后其胶类物质被分解，使得提取液的稠度下降，密度减小，一些溶液中的固体颗粒沉淀致提取液变得澄清透明。

图1和图2在色泽因素上得分都处于5～6，呈乳黄色和微黄色，呈乳黄色的海带酒主要是由果酒酵母发酵而成，因为果酒酵母中的配方有乳化剂，赋予酒香气和浊度。酒味这个因素相差的比较大，原因是使用的3种发酵剂菌种不同，作用的机理不同：甜酒曲主要用于制作甜酒酿，故发酵的酒其甜度会较其他2种菌要甜的多。酿酒曲主要是生产白酒的菌种，其發酵的酒，酒精度数会相对较高。果酒曲是发酵果蔬类的菌种，其发酵的酒精度数不会很高，并且会带有点甜味。

评定员要参考以上5个因素的评定并结合自身的偏好，在第6个因素风格上给样品综合打分评定。这个分数是较为重要的，因为该试验的目的是制作出一类较符合大众口味的海带酒，由图1和图2可以得出最优发酵剂是酿酒曲和果酒曲的混合菌种，酿酒曲能够酿造酒精度较高的酒，而果酒曲在风味和口味上作出贡献，这2种菌的混合菌种发酵的海带酒较符合大众的口味。

2.2海带提取液参数优化正交试验

3因素3水平的海带提取液正交试验结果及分析见表2。最优发酵剂酿酒曲和果酒曲的混合菌种发酵制得的9种海带酒感官评定QDA图见图3。

由表2中的R值可以看出，影响海带酒品质的主要因素是海带提取液浸提温度和浸提时间，料液比的影响不显著。正交试验优化的参数组合为A3B3C1，即浸提温度为90 ℃、浸提时间5 h、料液比为1∶20 g/ml。结合图3，可以明显看出提取液6、8、9发酵的海带酒感官评定较好，其参数分别是：提取温度90 ℃、浸提时间3 h、料液比1∶20 g/ml；提取温度70 ℃、浸提时间5 h、料液比1∶30 g/ml；提取温度90 ℃、浸提时间5 h、料液比1∶25 g/ml。综合考虑，为了节约时间，最适提取液参数为温度90 ℃、时间3 h、料液比1∶20 g/ml。 由图3还可以看出，不同的提取条件对澄清度和甜味的影响不显著，对于色泽和风格的影响最大，酒味和海带味次之。

2.36种菌种发酵海带酒的抗氧化性

以最适提取条件下（温度90 ℃、时间3 h、料液比1∶20 g/ml）获得的海带提取液为原料，不灭菌直接添加6种发酵剂制备海带酒，后发酵25 d进行抗氧化性的测定，结果见表3。从表3中的清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH 自由基的能力测定结果可知，这6种海带酒的抗氧化性均比较高。根据文献研究，海带中还有多酚类物质，多酚具有抗氧化性，并且海带多糖也有抗氧化性。结合文献，分析该试验的6种海带酒抗氧化性高的原因，很可能是由于海带酒中的多酚类物质及海带多糖的作用。