超声诱导提取大豆中脂肪氧合酶的工艺研究

丁文武，孟丽，丛林娜，夏云空

（1.西华大学生物工程学院，四川成都610039；2.山东胜通集团股份有限公司，山东东营257500；3.中国科学院上海高等研究院，低碳转化科学与工程重点实验室，上海201210；4.四川大学生命科学学院，四川成都610065）

超声诱导提取大豆中脂肪氧合酶的工艺研究

丁文武1，孟丽2，丛林娜3，夏云空4

（1.西华大学生物工程学院，四川成都610039；2.山东胜通集团股份有限公司，山东东营257500；3.中国科学院上海高等研究院，低碳转化科学与工程重点实验室，上海201210；4.四川大学生命科学学院，四川成都610065）

应用超声诱导法对大豆中脂肪氧合酶进行了粗提，并考察了超声温度、时间和固液比对提取大豆中脂肪氧合酶的影响，并通过正交试验进一步优化实验条件；结果表明，大豆中脂肪氧合酶提取单因素影响最佳工艺条件为超声温度35℃、时间25 min、固液比1∶25 g∶mL；正交实验最佳工艺条件为超声温度30℃，时间30 min，固液比1∶30 g∶mL，此条件下所得酶活为4 033 U/mL，因此这种方法更简单迅速，提取率也更高。

大豆；脂肪氧合酶；超声波；提取

脂肪氧合酶属氧化还原酶，通称脂氧酶（LOX）［1］。LOX广泛分布于各种植物中，在豆类中具有较高的活力，其中尤以大豆中活力最高［2］，许多研究结果表明LOX在植物生理，如植物萌发、生长、发育、衰老和抗性等物质转化中起某种重要调节作用，可以运用于植物抗病、抗虫和伤害反应［3］；脂肪氧合酶也可用于漂白含有类胡萝卜素的植物或海洋食品物质。这样它可用于漂白制作面包、面条或意大利面食的面粉或者漂白含有虾青素的鱼肉或鱼油，因此对LOX的研究和应用工作也正逐渐深入进行［4-7］。

酶的提取方法有很多，包括高速组织捣碎［8］、玻璃匀浆器匀浆［9］、反复冻融法［10］、化学处理法、超声波处理法［11］等。其中超声提取法是研究最为广泛的一种。超声提取是利用超声波具有的机械效应，空化效应和热效应，通过增大介质分子的运动速度、介质的穿透力以提取生物有效成分［12］，在天然产物有效成分的提取过程中日益得到科研工作者们的充分重视［13-14］。

本试验以大豆为原料，通过超声诱导法提取大豆中脂肪氧合酶，寻找其提取的最佳工艺条件，一方面对脂肪氧合酶的酶学性质研究提供帮助，同时也为大豆制品的研究和利用提供一定参考。

1材料和方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 材料

大豆：大润发济南历下店；石油醚：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；无水乙醇：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；亚油酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；吐温20：化学纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器

酸度计：上海般特仪器制造有限公司；超声波清洗机：宁波新芝生物科技有限公司；电热恒温水浴锅：上海森信仪器有限公司；双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；TG-16高速离心机：巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 脱脂豆粉样品的制备

大豆经搅拌器打碎，用40目标准检验筛去皮，称取一定质量的大豆粉，用石油醚浸泡5次，其中固液比为1∶5（g∶mL），每次浸泡3 h，得到脱脂豆粉，然后于室温下晾干并在4℃条件下保存备用［15］。

1.2.2 影响因素的测定

固液比影响：将不同固液比样品于20℃下超声15 min，离心后将所得上清液配成相同体积后测酶活；超声时间影响：将一定固液比的样品于20℃下超声不同时间后，离心取上清液测酶活；超声温度影响：将一定固液比的样品在不同温度下超声一定时间后，离心取上清液测酶活。

1.2.3 酶活测定

底物溶液的配制：将0.25 mL的TWeen20溶液分散于10 mL pH 9.0的硼酸盐缓冲溶液中，摇动下逐滴加入0.27 mL亚油酸，然后向体系中加入一定浓度的NaOH溶液使其澄清，再用HCl溶液将体系pH调至9.0，最后把上述溶液用pH 9.0缓冲液定容到500 mL，保存备用［15-16］。

酶活测定：将0.2 mL粗酶液加入到1.5 mL底物溶液中，混匀后于25℃恒温水浴锅中恒温反应3 min，再向体系中先后各加入5 mL无水乙醇和水，混匀后用分光光度计在234 nm处测定反应液的吸光度［15］；空白试验为加入粗酶液和无水乙醇后，再加入底物溶液，其余操作与反应样品操作相同；酶活的计算是以1 min内反应体系的吸光度增加0.001作为一个酶活力单位［15］。

2结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 固液比对提取酶活的影响

固液比对提取酶活的影响如图1所示。

图1 固液比对提取酶活的影响Fig.1Effect of solid-to-liquid ratio of ultrasonic treatment on enzyme activity

由图1可知随着液固比的增大，酶活先增大后减小，这是由于随着液固比的增大，酶加入量相对减少，溶液较稀薄，则原料颗粒被破碎的机会越大，提升了超声波的效果，有利于酶的溶出；但是当液固比超过一定比例后，细胞内外的渗透压减小，酶的溶出速度减慢，酶的提取活性降低［14］。因此确定最佳固液比为1∶25。

2.1.2超声时间对提取酶活的影响

超声时间对提取酶活的影响如图2所示。

图2 超声时间对提取酶活的影响Fig.2Effect of time of ultrasonic treatment on enzyme activity

由图2可知，酶活随着超声时间的增加呈现出先增加后减少的趋势，其最佳超声时间出现在25 min左右。这可能是由于超声开始的一段时间里，随着超声时间的延长，形成的气泡越多，高频振荡越剧烈，吸收的声能越大，破壁的效果越好，因而酶的溶出量就越多［17］；但是由于超声的强烈震荡及热效应的作用会导致酶活力下降，并且细胞内大量不溶物及较多的粘液混入提取液中，使溶液中杂质增多黏度增大，从而增大了传质阻力影响酶的溶出，因而超声时间亦不能过长。

2.1.3 超声温度对提取酶活的影响

图3显示的是超声温度对提取酶活的影响。

图3 超声温度对提取酶活的影响Fig.3Effect of temperature of ultrasonic treatment on enzyme activity

如图所示，当温度为35℃左右时，经超声处理的酶活性最大，而低于35℃或高于35℃时，均表现为酶活的下降，因此最佳超声温度在35℃左右。这可能是由于温度偏低，酶的活性较低；而超过一定温度后，则会破坏酶的空间构象［18］，造成酶的活性成分被破坏，使酶的活性降低，同时使杂质的溶出量增加，也阻碍了酶促反应的进程，降低了反应速率。

2.2 正交试验

由单因素所做结果，选出最佳数据，根据正交组合的原则，每个因素选出由最佳数据组成的三个水平，组成四因素三水平的正交表，如表1所示。

表1 正交试验结果与分析Table 1Results and analysis of thogonal test

由表1可知，3个因素对提取效果的影响主次顺序为：超声温度＞超声时间＞固液比，因此正交实验的最佳条件是温度30℃、时间30 min、固液比1∶30；对正交优化后所选择的工艺条件进行了验证（见表2所示），结果表明：此条件下所得酶活为4 033 U/mL。

表2 正交试验的最佳工艺条件测定结果Table 2Results of optimum condition from thogonal test

3结论

应用超声诱导法对大豆中脂肪氧合酶进行了粗提，考察了超声温度、时间和固液比对提取大豆中脂肪氧合酶的影响，并进行了正交试验以得到最佳提取工艺条件；单因素影响最佳工艺条件为超声温度35℃、时间25 min、固液比1∶25（g∶mL）；正交试验最佳工艺条件为超声温度30℃，时间30min，固液比1∶30（g∶mL），此条件下所得酶活为4 033 U/mL，因此这种方法更简单迅速，提取率也更高。

［1］陈书婷，孔祥珍，华欲飞，等.大豆脂肪氧合酶的分离纯化及其性质研究［J］.食品工业科技，2011（5）：176-182

［2］王璋.食品酶学［M］.北京：中国轻工业出版社，1991：279

［3］蔡琨，方云，夏咏梅，等.大豆脂肪氧合酶的提取及影响酶活因素的研究［J］.林产化学与工业，2004，24（2）：52-54

［4］蔡棍，方云，夏咏梅.植物脂肪氧合酶的研究进展［J］.2003，23：23-27

［5］石胜尧，张延坤，郭大发.大豆脂肪氧化酶活性的测定［J］.营养学报，1996，18（3）：354-357

［6］Vega M，Karboune S，Kermasha S.Stability of immobilized soybean lipoxygenase in selected organic solvent media［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2005，127：29-42

［7］Cai Y，Xu H，Xia Y，et al.A proof for substitution of endogenous iron（II）in lipoxygenase by exogenous Cu2+［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，162：1147-1152

［8］刘军山，肖凯军.苹果多酚氧化酶的提取及其抑制作用的研究［J］.现代食品科技，2006，22（4）：82-85

［9］李晓莉，沈金山，黄家音.山药多酚氧化酶特性研究［J］.精细化工，2005，22（7）：527-529

［10］孟雅，李刚，张龙.马铃薯多酚氧化酶的提取纯化条件对其活性影响的研究［J］.化学工程，2006，23（10）：47-49

［11］肖贵平.木瓜蛋白酶超声法提取工艺及其酶学性质［J］.福建农林大学，2005，34（3）：318-323

［12］王毕妮，张富新.超声技术在皱胃酶提取中的应用［J］.中国乳品工业，2005，33（11）：54-56

［13］肖贵平.木瓜蛋白酶超声法提取工艺及其酶学性质［J］.福建农林大学，2005，34（3）：318-323

［14］熊海涛.超声诱导法提取土豆中多酚氧化酶的工艺研究［J］.食品研究与开发，2012，33（7）：32-35

［15］钟芳，王璋，许时婴.3种脂肪氧合酶酶活测定方法［J］.无锡轻工大学学报，2001，20（1）：77-91

［16］田其英，华欲飞.大豆脂肪氧合酶研究进展［J］.粮食与油脂，2006（8）：6-9

［17］熊海涛，郑行望，唐志华.超声诱导法提取香蕉中多酚氧化酶的工艺研究［J］.食品研究与开发，2011，32（5）：24-26

［18］李冰，王文宗，林鸿佳，等.超声波对过氧化氢酶酶活影响的机理［J］.华南理工大学学报，2010，38（12）：129-134

Extraction of Lipoxygenase from Soybean by Ultrasonic Treatment

DING Wen-wu1，MENG Li2，CONG Lin-na3，XIA Yun-kong4
（1.School of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China；2.Shan Dong Sntion Group Co.，Ltd.，Dongying 257500，Shandong，China；3.Shanghai Advanced Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201210，China；4.College of life Science，Sichuan University，Chengdu 610065，Sichuan，China）

The influence factors including extraction temperature，time and solid-to-liquid ratio were studied by single factor test and orthogonal test to obtain the optimum conditions of extracting lipoxygenase in soybean by ultrasonic Treatment.The optimum conditions of extracting lipoxygenase in soybean，determined by single factor test，were as follows：extraction temperature 35℃，time 25 min and solid-to-liquid ratio 1∶25 g∶mL. On the basis of the single factor test，orthogonal test was carried out and the results showed that the optimum conditions were extraction temperature 30℃，time 30 min and solid-to-liquid ratio 1∶30 g∶mL，on which the enzyme activity was 4 033 U/mL.It was simple and fast to extract lipoxygenase in soybean by ultrasonic treatment，and the exaction rate was also higher.

soybean；lipoxygenase；ultrasonic wave；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.014

2014-08-19

四川省教育厅一般项目（15ZB0126）；西华大学2014年校重点科研基金项目（z1420523）

丁文武（1980—），男（汉），讲师，博士，研究方向：酶的提取和应用。