黄色短杆菌产L-精氨酸发酵培养基的优化

赵鑫，肖玉平，李立英

（1.广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东广州510300；2.广东高校特色调味品工程技术开发中心，广东广州510300）

黄色短杆菌产L-精氨酸发酵培养基的优化

赵鑫1，2，肖玉平1，李立英1

（1.广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东广州510300；2.广东高校特色调味品工程技术开发中心，广东广州510300）

在液体培养条件下，采用单因素试验法，考察了发酵培养基中不同浓度的碳源、氮源、无机盐和生物素对实验室筛选获得的黄色短杆菌L-Arg高产突变株GC 1325产酸的影响，确定了碳源和氮源的初始浓度和补加方式。实验结果表明，GC 1325发酵的最优培养基为：葡萄糖100 g/L，（NH4）2SO425 g/L、KH2PO41.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.6 g/L、生物素100 μg/L；发酵过程中24 h后一次流加50 g/L葡萄糖维持碳源；连续流加25%的氨水维持（NH4）2SO4浓度在25 g/L水平，在此优化的培养条件下，GC 1325获得的最大的L-Arg产量为37.8 g/L，比优化前提高了58.8%。

黄色短杆菌；发酵培养基；优化；L-精氨酸

L-精氨酸（L-Arginine，简写L-Arg）是氨基酸中的重要品种之一，是合成蛋白质和肌酸的重要原料，在医药、营养保健、食品工业等领域应用广泛［1］。随着人们生活水平的提高，Arg的需求量逐年递增，而国内L-Arg的生产技术落后，依赖从日本等国家进口［2］。LArg工业化生产的关键是发酵，发酵水平的高低决定产品成本。提高发酵水平的途径有二条：一是选育适合工业化生产的优良菌种；二是获得与生产菌种相匹配的最佳发酵条件［3］。培养条件的优化与否直接影响到代谢方式及代谢流量的变化［4］，从而影响到目的产物的产量。发酵条件优化的研究也是实现菌株从实验室研究阶段，迈向工业生产阶段的一个必经之路。本文采用单因素试验法，优化了本实验室筛选获得的LArg高产突变菌株GC1325的发酵培养基，在一定程度上提高了菌株的产酸量。

1材料与方法

1.1菌种

本实验室筛选获得的L-Arg高产突变株GC 1325（Brevibacterium flavum，His-，Suc-，D-Argr，SMCr）。

1.2培养基

1.2.1基础培养基（g/L）

葡萄糖10，（NH4）2SO43，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，琼脂20，生物素3×10-5，硫胺素2×10-4，L-组氨酸5×10-4。pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min。

1.2.2种子培养基（g/L）

葡萄糖30，玉米浆20，（NH4）2SO420，KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，尿素1.5。pH7.0～7.2，121℃灭菌20min，装液量30 mL/250 mL。

1.2.3发酵培养基（g/L）

葡萄糖，玉米浆25，（NH4）2SO4，KH2PO41.2，MgSO4·7H2O 0.6，FeSO4·7H2O 0.02，生物素1×10-4，L-组氨酸5×10-4，CaCO330。pH7.0～7.2，121℃灭菌15 min。（葡萄糖和硫酸铵浓度根据实验需要调整）。

1.3主要试剂

酵母膏、组氨酸、生物素等为国产生化试剂；其他试剂均为国产分析纯。

1.4主要仪器

往复式摇床摇床：无锡查桥轻机厂；5 L自动控制发酵罐：上海保兴生物设备工程有限公司（Biotech-2001）；722分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.5主要实验方法

1.5.1发酵条件

摇瓶发酵为250 mL三角瓶装液30 mL，发酵结束后补水至原体积。5 L发酵罐中装液量2.5 L，接种量6%～8%，流加25%的氨水控制pH在7.0。通风量4 L/min，搅拌转速为600 r/min。

1.5.2氨离子的浓度测定

纳氏试剂法。

1.5.3培养液光密度值的测定

取培养好的培养液用0.25 mol/L的HCl适当稀释后，以0.25 mol/L的HCl为空白对照，用721分光光度计测定OD值。

1.5.4发酵液中还原糖的测定

3，5-二硝基水杨酸法。

1.5.5L-Arg的定量测定

改良坂口试剂法［5］。

2结果与讨论

2.1碳源对L-Arg发酵过程的影响

2.1.1不同碳源对L-Arg产量的影响

碳源是构成菌体和合成氨基酸的碳架及能量的来源。不同微生物所具有的酶系不同，所能利用的碳源也不同。目前发现精氨酸产生菌均不能利用淀粉，分别在发酵培养基中添加100 g/L的不同常用碳源，产酸量的结果见表1所示。

表1　不同碳源对精氨酸产量的影响Table 1Effects of different carbon sources on the yield of L-Arginine

由表可知，以葡萄糖、蔗糖作为唯一碳源时，该菌株的L-Arg产量较高。考虑到原料来源，确定以葡萄糖为碳源。

2.1.2不同初糖浓度对GC1325产酸及糖利用的影响

采用摇瓶分批发酵，考察了初糖浓度分别为60、100、140和180 g/L的条件下的发酵过程，结果如图1所示。

图1　不同的初始葡萄糖浓度对OD值和L-Arg产量的影响Fig.1Effects of different initial glucose concentrations on OD value and the yield of L-Arginine

从整个发酵过程来看，60 g/L的初始葡萄糖对GC1325菌体生长最为有利，该条件下菌体生长最早达到平衡期，100 g/L的葡萄糖次之，140、180 g/L的葡萄糖则对菌体生长有一定的抑制作用，菌体生长达到平衡期的时间较低糖浓度时明显延长。此外，60、100 g/L的初糖浓度时，发酵终了的残糖较低，分别为0和4.7 g/L；而140、180 g/L的初糖浓度下的发酵终了葡萄糖残糖较高，分别为44.2和83.6 g/L，不利于糖酸转化率的提高以及产品的后续生产。初始葡萄糖浓度为60、100 g/L时发酵前期（0～48 h）精氨酸的合成速率较快，但葡萄糖消耗速率也较高糖浓度时快，造成后期（48 h）发酵液中残留葡萄糖浓度偏低（0～50 g/L），此时精氨酸合成速率降低，因而最终精氨酸的积累量偏低。

比较不同初糖浓度下精氨酸的生产强度和糖酸转化率（表2所示）可以发现，初始葡萄糖浓度为100、140 g/L时，两者的生产强度相近，但100 g/L的初始葡萄糖浓度下的糖酸转化率高于初糖浓度为140 g/L时的糖酸转化率。

表2　不同初糖浓度下糖酸转化率和L-精氨酸的生产强度Table 2Effects of different initial glucose concentrations on glucose acid invert ratio and the L-Arg productivity

2.1.3葡萄糖补加时间的确定

100 g/L的初始葡萄糖浓度下存在发酵后期葡萄糖浓度偏低，产酸能力下降的问题，考虑在发酵过程中补加葡萄糖补充碳源。分别在不同时间一次补加50 g/L葡萄糖，考察了不同的补加时间对发酵96 h后产酸量和最终残糖浓度，结果如图2所示。

图2　不同的补加葡萄糖时间对L-Arg产量和残糖浓度Fig.2Effects of different glucose fed time on the yield of LArginine and the residual sugar concentration

由图2并结合前面的结果可以看出，初糖浓度过高会明显抑制菌体生长，而补糖则可以明显改善后期糖浓度不足引起的产酸下降状况；从精氨酸合成的角度来看，发酵至24 h时补加葡萄糖的效果最好，且该条件下发酵终了时残糖浓度最低。

2.2氮源对L-Arg发酵过程的影响

2.2.1不同氮源对于GC1325发酵的影响

发酵培养基中必须含有较高比例的氮源才可以满足菌体生长和合成L-Arg的需要。不同氮源菌株的产酸量见表3所示。

表3　不同氮源对精氨酸产量的影响Table 3Effects of different nitrogen sources on the yield of L-Arginine

由表可知，以硫酸铵作氮源时，可获得最大的产酸量。硫酸铵是培养基内的无机“速效氮源”，它更容易被早期增殖生长的菌体所利用。

2.2.2硫酸铵浓度及其流加方式对GC1325发酵的影响

采用摇瓶发酵考察了不同初始硫酸铵浓度（25、50、75 g/L）对L-Arg发酵过程的影响结果见图3所示，体系中的硫酸铵的代谢曲线见图4所示。

图3　不同的初始浓度硫酸铵对OD值和L-Arg产量的影响Fig.3Effects of different initial ammonium sulfate concentrations on OD value and the yield of L-Arginine

图4　不同初始浓度硫酸铵的代谢曲线Fig.4The Metabolic profile of different initial ammonium sulfate concentrations

从整个发酵过程看，初始硫酸铵浓度为25 g/L时，菌体生长较快；而初始硫酸铵浓度为50 g/L时，菌体生长量偏低，这充分说明发酵液初始硫酸铵浓度过高对菌体生长有一定的抑制作用。但是，初始硫酸铵浓度为25 g/L时，40 h时L-Arg的产量达到最大值9.73 g/L。但40 h～96 h段，虽然菌体中精氨酸合成酶系具有较高的活力，但体系硫酸铵的含量为0，缺少氮源，无法合成精氨酸，L-Arg的产量不再上升。而初始硫酸铵浓度为50 g/L和75 g/L时，在整个发酵过程中L-Arg产量呈持续上升趋势，当发酵至96 h时，初始硫酸铵浓度为75 g/L的L-Arg产量略高于初始硫酸铵浓度为50 g/L的产量，但2种发酵液中均残存大量的硫酸铵。

综合以上分析，初始发酵液中高浓度硫酸铵对菌体生长有一定的抑制作用，且最终发酵液中剩余的硫酸铵也较多，损耗较大。而分次添加硫酸铵既可以降低高浓度硫酸铵对菌体生长的抑制作用，又能在发酵过程中维持较高的硫酸铵浓度来提供菌体的产酸需要。而初始氮源浓度25 g/L时，整个发酵体系有最大的比生长速率、最大的L-Arg生成速率、最大的葡萄糖消耗速率和最大的硫酸铵消耗速率。因此，初始硫酸铵浓度定为25 g/L，后续通过连续流加25%的氨水，使硫酸铵浓度维持在25 g/L的水平，既满足了菌体合成精氨酸所需的氮源，解除了高浓度氮对菌体生长的抑制，又可以使发酵体系pH维持在7.0，消除因精氨酸合成引起的体系pH下降对菌体活力的不利影响。

2.3无机盐对发酵产酸的影响

硫酸镁是细胞内L-Arg代谢途径中很多重要酶的激活剂，如图5所示。

图5　不同的无机盐（硫酸镁、磷酸二氢钾）添加量对L-Arg产量的影响Fig.5Effects of different addition of inorganic salts（MgSO4· 7H2O，KH2PO4）on the yield of L-Arginine

缺少了硫酸镁时菌体内酶的活性偏低，长势微弱，目标产物L-Arg的合成也大幅度减少，当培养基内硫酸镁的浓度为0.6 g/L时就基本不会影响产量。说明菌体生长的硫酸镁最低需求量为0.6 g/L。当培养基内含有1.2 g/L的磷酸二氢钾时，L-Arg的产量达到最高，低于此值时，菌体的糖代谢动力不足，生长缓慢；而添加量过高，糖代谢过于迅速，过多的葡萄糖被用作菌体细胞生长，不利于L-Arg的积累。因此，选取1.2 g/L的磷酸二氢钾浓度为宜。

2.4生物素的最佳添加量

在L-Arg合成中加入生物素可利用它对细胞膜通透性的影响，使胞内L-Arg的合成前体物谷氨酸不易流出，有利于代谢流多向L-Arg合成的方向流动。如图6所示。

图6　不同的生物素添加量对L-Arg产量的影响Fig.6Effects of different addition of biotin on the yield of LArginine

当生物素的添加浓度达到100 μg/L，L-Arg的产量达到最大。而生物素添加量过多则会引起产量下降，可能是由于过多的生物素会使菌体生长繁殖时间变长，菌量增多，后续代谢过程中对氧的消耗严重，谷氨酸的分泌下降，因此L-Arg产量也相应降低。

3结论

采用单因素试验法，确定了黄色短杆菌L-Arg高产突变株GC1325发酵的最优培养基为：葡萄糖100g/L，（NH4）2SO425 g/L、KH2PO41.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.6 g/L、生物素100 μg/L；发酵开始后24 h后一次补加葡萄糖50 g/L补充碳源，发酵过程中连续流加25%的氨水维持（NH4）2SO4浓度在25 g/L，在此优化的培养条件下培养，GC1325获得的最大产L-Arg量为37.8 g/L，比优化前GC1325的L-Arg的产量23.8g/L提高了58.8%。

［1］陈雪岚，许正宏，陶文沂.产L-精氨酸基因工程菌的研究［J］.食品与发酵工业，2003，129（12）：97-102

［2］Kiyoshi N，Hajime Y．Fermentative Production of L-Arginine［J］.A－gricultural and Biological Chemistry，1972，36（10）：1675-1684

［3］张义萍，张伟国.优化L-精氨酸发酵培养基［J］.发酵科技通讯，2006（2）：18-20

［4］朱进伟，张伟国.L-精氨酸发酵代谢调控的初步研究［J］.食品工业科技，2008（7）：131-133

［5］贺小贤，孙莹，陈合.发酵液中L-精氨酸的检测方法［J］.食品与药品，2007（1）：18-20

Optimization of Fermentation Medium for L-Arginine Production with Brevibacterium Flavum

ZHAO Xin1，2，XIAO Yu-ping1，LI Li-ying1
（1.Department of Food and Bioengineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，Guangdong，China；2.Center of Guangdong Higher Education for Engineering and Technological Development of Speciality Condiments，Guangzhou 510300，Guangdong，China）

At the liquid culture conditions，the fermentation medium of GC 1325，the high yielding of L-arginine strain mutagenized form brevibacterium flavum optimized using single factor test.Different concentrations of carbon sources，nitrogen sources，inorganic salts，and thiamine effect on the production of L-arginine were studied.The initial concentration of carbon sources，nitrogen sources and additional way were confirmed.The experimental results show that the optimal fermentation medium for GC 1325：glucose 100 g/L，（NH4）2SO425 g/L，KH2PO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，biotin 100 μg/L；Glucose（50 g/L）fed once at 24 h and 25%aqueous ammonia fed continuously to maintain the（NH4）2SO4concentration was 25 g/L in the fermentation process.At this optimization of culture conditions，the maximum yield of L-arginine was 37.8 g/L，which was increased by 58.8%.

brevibacterium flavum；fermentation medium；optimization；L-arginine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.031

2014-04-01

赵鑫（1982—），男（汉），讲师，博士，研究方向：生物制药技术。