HPLC法测定锦灯笼果实中5种黄酮类成分含量

王志颖，宗颖，孙佳明，杜锐，*

（1.吉林农业大学，吉林长春130118；2.长春中医药大学，吉林长春130117）

HPLC法测定锦灯笼果实中5种黄酮类成分含量

王志颖1，宗颖1，孙佳明2，杜锐1，*

（1.吉林农业大学，吉林长春130118；2.长春中医药大学，吉林长春130117）

建立同时测定锦灯笼果实中5种黄酮类成分的高效液相色谱方法，为以后的锦灯笼质量评价研究做铺垫，并对5个不同产地的锦灯笼果实中黄酮含量进行测定。采用HPLC法，流动相甲醇-水，梯度洗脱；柱温30℃；流速1.0 mL/min；检测波长350 nm。结果表明5种黄酮类成分的线性关系良好，精密度、稳定性良好，符合测定要求。采用高效液相色谱法测定锦灯笼果实中5种黄酮类成分方法简便、准确，对5个不同产地样品测定结果稳定，重现性好。

锦灯笼果实；高效液相色谱；黄酮

锦灯笼（Physalis alkekengi，L.var.francheti（Mast.）Makino）又名酸浆、挂金灯、灯笼果、红姑娘等，为茄科（Solanaceae）酸浆属植物，在俄罗斯、韩国、中国、日本以及朝鲜等国家都有生长，广泛分布于欧亚大陆［1-3］。在《神农本草经》中记载，被列为中品［4］。锦灯笼的根，全草及果实均可入药，其果实性味甘，有清凉解毒，消肿止痛，利尿，止咳，化痰之功效［5-6］。作为我国的传统中药，现代研究表明，锦灯笼有多方面的药理作用［7-10］。锦灯笼中含有的黄酮类化合物种类较多，具有较好的生物活性，对锦灯笼质量评价具有较大的意义［11-12］。

本实验以木犀草苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素5种黄酮类化合物为指标，采用超声辅助溶剂提取法对样品进行处理，建立高效液相色谱法同时检测5种黄酮含量的条件，并检测了5个不同产地样品中黄酮含量，测定结果稳定，准确。

1材料与方法

1.1材料

锦灯笼果实由宗颖老师提供，鉴定为茄科（Solanaceae）酸浆属植物锦灯笼（Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino）。

木犀草苷（0724-200806）、芦丁（10008-200707）、槲皮苷（10183-201009）、槲皮素（11082-200705）、木犀草素（10008-200903）均购自中国药品生物制品检定所；甲醇（色谱纯）：美国Fisher公司；乙醇（分析纯）：北京化工厂。

1.2仪器与设备

LC-2010液相色谱仪（SPD-20Avp紫外检测器、柱温箱、化学工作站）、UV2450紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；Nucleosil C18ODS色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）：大连依利特公司；KQ-250DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1对照品溶液的制备

精密称定木犀草苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素各10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容，制成混合对照品溶液。

1.3.2样品溶液的制备

准确称取锦灯笼果实样品10.0 g于250 mL锥形瓶中，取90%乙醇150mL，超声提取3次，每次30min，合并提取液，浓缩至干，用甲醇定容于10 mL容量瓶，制成样品溶液，测定前用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.3.3色谱条件

Nucleosil C18ODS色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）和水（B）；梯度洗脱：0～15 min 35%～40%（A），15 min～30 min 40%～50%（A），30 min～40 min 50%～55%（A）；检测波长：350 nm；柱温：30℃；流速：1 mL/min；进样量：20 μL。

1.3.4标准曲线的制备

精密移取1.3.1项的混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，分别置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，得到不同浓度的混合对照品溶液，采用1.3.3项液相条件，测定5种黄酮峰面积，以各浓度为横坐标（x）、积分面积值为纵坐标（y），进行线性回归计算，得混合标准品溶液中5种黄酮的回归方程。

2结果与分析

2.1混合对照品及锦灯笼样品色谱峰

混合对照品色谱峰见图1，锦灯笼样品色谱峰见图2。

2.2混合标准品中5种黄酮的线性回归方程

5种黄酮的线性回归方程见表1。

以黄酮浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到标准曲线。本方法测定锦灯笼果实中木樨草苷、芦丁、槲皮素苷、槲皮素、木樨草素，线性关系良好。

图1　混合标准品色谱峰Fig.1HPLC chromatograms of mixed standard

图2　锦灯笼样品色谱峰Fig.2HPLC chromatograms of sample

表1　5种黄酮的线性回归方程Table 1Regression equations with correlation coefficients of 5 flavonoid

2.3方法学考察

2.3.1精密度实验

按“1.3.3”条件，取黄酮混合标准品连续进样6次，测定得到峰面积，计算木犀草苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素峰面积的RSD值分别为1.32%、1.71%、0.96%、1.08%、1.19%（n＝6），表明精密度良好。

2.3.2稳定性实验

取黄酮混合标准品，按“1.3.3”条件，分别于0、0.5、1、1.5、2.0、2.5h进行测定。结果表明，标准品溶液色谱峰面积无明显变化，计算木犀草苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素峰面积的RSD值分别为2.41%、1.69%、1.03%、2.11%、1.33%（n＝6），表明稳定性良好。

2.3.3重复性实验

取同一锦灯笼样品溶液，按“1.3.3”条件下连续进样6次，测定得到峰面积，计算木犀草苷、芦丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素峰面积的RSD值分别为1.13%、1.17%、2.07%、1.59%、2.52%（n＝6），表明本方法重复性较好。

2.3.4加样回收率实验

精密量取标准品溶液与6份已知各黄酮含量的锦灯笼样品溶液混合，浓缩至干，定容，按“1.3.2”项操作，在“1.3.3”条件下进行测定。结果见表2。

表2　5种黄酮的加标回收率实验结果（n＝6）Table 2Recovery rates of 5 flavones in a known sample（n＝6）

结果表明，本实验提取和处理方法对锦灯笼种黄酮类成分的回收率介于99%～103%，符合测定要求。

2.4不同产地锦灯笼中黄酮的含量测定

5种不同产地锦灯笼果实中黄酮含量见表3。

表3　5种不同产地锦灯笼果实中黄酮含量Table 3Contents of flavones in Physalis alkekengi L.var.franchetii from 5 different area

在不同产地的锦灯笼果实黄酮含量测定中发现，在距离较近的地区，黄酮含量差异较小，但长春地区锦灯笼中黄酮含量较高，在吉林和通化地区黄酮含量较低，而且吉林和通化锦灯笼中黄酮含量相差也较大。

3讨论与结论

锦灯笼中的黄酮类成分热稳定性较差，为了不破坏锦灯笼中的待测成分，采用超声提取法，在室温条件下对锦灯笼进行提取。在此条件下制备的样品溶液在测定指标区域内峰型简单，没有其他成分干扰。

对于锦灯笼中的黄酮类成分测定方法较多，主要采用紫外分光光度法测定，或是采用HPLC法对锦灯笼中单一成分进行含量测定［13-14］。在前人的工作的基础上，综合其他植物中黄酮类成分的测定方法，建立了HPLC法同时测定锦灯笼中的5种黄酮类成分的条件，具有分离度好，准确性高，方法简便可行，不仅为以后锦灯笼果实的化学成分研究提供了很好的理论依据，同时也为锦灯笼在食品控制和质量评价上建立了较好的方法。

采用本实验建立的方法对不用产地的锦灯笼果实中黄酮进行了含量测定，结果显示，长春地区的锦灯笼果实的黄酮含量较高，为以后的锦灯笼进一步研究提供参考。

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HPLC Determination of 5 Flavones in Physalis alkekengi，L.var.

WANG Zhi-ying1，ZONG Ying1，SUN Jia-ming2，DU Rui1，*
（1.Jilin Agricutural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China）

A high performance liquid chromatography method was established to simultaneously determine 5 flavones，Physalis alkekengi，L.var.fruit quality evaluation research is made later，and Contents of flavones from 5 different area is determined。5 flavones were separated by HPLC，with amobile phasecomposed of acetonitrile and water at a flow rate of 1.0 mL/min through gradient elution.The detection wavelength was 350 nm.An excellent linear relationship between peak areas and concentrations of 5 flavones is established.By high performance liquid chromatography determination of 5 kinds of flavonoids in Physalis alkekengi，L.var.fruit composition method is simple and accurate，and 5 different origin samples determination result is stable and reproducible.

Physalis alkekengi，L.var.fruit；HPLC；flavonoid

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.023

2014-03-04

吉林省教育厅科学技术研究项目（吉教科合字［2012］第50号）

王志颖（1991—），女（汉），硕士研究生，主要从事中药有效成分的研究与开发利用的研究工作。

杜锐（1971—），男（汉），教授，博士，主要从事中药物质基础研究工作。