石榴皮分级提取物的抗氧化性能比较

唐丽丽，刘邻渭，祝战斌

（1.杨凌职业技术学院生物工程学院，陕西杨凌712100；2.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

石榴皮分级提取物的抗氧化性能比较

唐丽丽1，刘邻渭2，祝战斌1

（1.杨凌职业技术学院生物工程学院，陕西杨凌712100；2.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

研究比较四段分级提取石榴皮多酚产物的体外抗氧化活性的差异，并与VC进行了比较。结果表明：各级石榴皮多酚提取物都具有较强的清除自由基的能力，它们清除三种自由基的能力由大到小为：ABTS+自由基＞DPPH·自由基＞·OH自由基。石榴皮多酚粗提物经大孔树脂纯化以及乙酸乙酯萃取后，多酚含量提高，清除自由基的能力增强。各阶段产物对三种自由基的清除能力强弱顺序均为：乙酸乙酯相萃取物＞树脂纯化物＞水相保留物＞VC＞粗提物，它们的总抗氧化能力强弱顺序为：VC＞乙酸乙酯相萃取物＞树脂纯化物＞水相保留物＞粗提物，它们的还原能力强弱顺序为：乙酸乙酯相萃取物＞树脂纯化物＞VC＞水相保留物＞粗提物。这些结果说明：经过粗提、树脂纯化及乙酸乙酯萃取得到的石榴皮多酚具有相对最高的抗氧化性能。

石榴皮；多酚提取物；抗氧化活性

石榴（Punica granarum L.）又名安石榴、丹若、金罂等，是石榴科、石榴属（Punica L.）落叶灌木或小乔木。我国有着丰富的石榴品种资源，目前石榴资源开发的重点主要是是生产石榴饮料、酒、果酱、果冻以及营养保健品［1-2］。

石榴是我国重点发展的水果之一，其栽培面积正在逐年的扩大。石榴皮占到石榴总重的30%左右，但是在石榴汁、石榴酒等食品加工中大部分却被丢弃了，资源浪费严重［3］。

石榴皮性酸、味苦涩，为常用中药，主要治疗细菌性痢疾以及多种感染性疾病。石榴皮中富含多酚类和黄酮类化合物等生理活性成分，这些化合物可通过多种途径发挥抗氧化作用，例如清除自由基、淬灭活性氧、抑制氧化酶以及络合具有催化功能的金属离子等作用［4］。Saito Keita等［5］对1 000种中草药的抗氧化活性进行了研究，他们发现石榴皮的抗氧化能力位居前四，并且确定了多酚是其抗氧化能力的主要有效物质。Q.Zhang等［6］发现，石榴皮的丙酮、水、甲醇和乙酸乙酯等的提取物均具有抗氧化作用，并且具有明显的量效关系，多酚含量与抗氧化作用大小密切相关。

本研究在对石榴皮抗氧化物质提取研究的基础上，针对我们选用的最优提取工艺，进一步考察对比了石榴皮各级提取物的体外清除自由基及抗氧化功能的差别，为进一步深入研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

石榴皮：购自陕西临潼。

试剂：DPPH·，ABTS+，Sigma公司；抗坏血酸（VC），天津博迪化工公司；结晶紫、FeSO4、磷酸钠、钼酸铵、铁氰化钾、三氯乙酸等均是国内生产分析纯。

DPPH·贮备的配制：称取0.012 8 g DPPH，加入无水乙醇溶解于50 mL容量瓶中，定容摇匀后保存于冰箱中，作为贮备液（6.5×10-4mol/L），逐级稀释使用。

仪器设备：UV-1700型分光光度计：日本岛津公司；DHG-9030A电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司KQ-600DB型超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司；R-210型旋转蒸发仪：瑞士Bü CHI公司。

1.2方法

1.2.1石榴皮粗提物的制备

参考贾冬英等人的提取工艺［7］，将烘干后的石榴皮，粉碎后过40目筛，粉末贮于广口瓶中避光备用。以体积分数20%的乙醇为提取剂，料液比为1∶20，50℃下回流提取，时间为1 h，真空抽滤，得到石榴皮粗提液。

1.2.2石榴皮提取物的纯化

将石榴皮粗提液用大孔吸附树脂HZ-818进行纯化得大孔树脂纯化液，纯化条件为［8］：提取液上样浓度为2.5 mg/mL，上样流速为5 BV/h，pH为3，洗脱剂浓度为70%乙醇，解吸液流速为2 BV/h。

将以上所得大孔树脂纯化液旋转蒸发浓缩至原体积的约1/10，用乙酸乙酯进行充分萃取，采用少量多次的办法，得乙酸乙酯萃取相和水相。

将得到的石榴皮粗提液、大孔树脂HZ-818纯化液、乙酸乙酯萃取相和水相进行旋转蒸发、真空干燥后备用。

1.2.3石榴皮提取物中多酚类物质的含量测定

石榴皮粗提物、大孔树脂纯化物、乙酸乙酯相萃取物和水相保留物的总多酚、总黄酮、单宁的含量测定分别采用文献［9-11］给出的方法。

1.2.4石榴皮提取物抗氧化能力的测量

首先，将石榴皮粗提物、大孔树脂纯化物、乙酸乙酯相萃取物、水相保留物和VC样品分别配制不同浓度梯度的乙醇-水溶液，作为这些样品的试液，暂存于冰箱。

1.2.5清除·OH能力的测定

参考刘骏［12］和李荣等［13］描述的方法，测定步骤如下：

在3只10 mL试管中分别各加入0.3 mL浓度为0.4 mmol/L的结晶紫溶液和1.2 mL浓度为1.0 mmol/L的FeSO4溶液。然后，在其中一管中加入0.6 mmL蒸馏水，另一管中加0.6 mL浓度为2.0 mmol/L的H2O2溶液，第三只管中加0.6 mL浓度为2.0 mmol/L的H2O2溶液和1 mL样品试液。然后，各试管均用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH4.0）定容到10 mL并摇匀，放置30 min后，在580 nm处测定各管溶液的吸光度。

样品试液的按下式计算：

式中：A0为不加H2O2试管溶液的吸光度；As为加入样品试液试管溶液的吸光度，Ab为加有H2O2但不加样品试液试管溶液的吸光度。

1.2.6清除DPPH·能力的测定

参照TsaiSYetal［14］的测定方法。吸取10 mL DPPH·贮备液，用无水乙醇定容于100 mL容量瓶中，摇匀作为工作液。然后，取10 mL试管3只，1号试管中加入4 mL DPPH·工作液和1 mL蒸馏水，2号试管中加入4 mL DPPH·工作液和1 mL样品试液，3号试管中加入4 mL无水乙醇和1 mL样品试液，充分摇匀后，室温静置10 min，在波长517 nm处检测各管溶液的吸光度。

样品试液的DPPH·清除率用下式计算：

式中：A0为1号试管溶液的吸光度，Ai为2号试管溶液的吸光度，Aj为3号试管溶液的吸光度。

1.2.7清除ABTS+·能力的测定

参照韩光亮等［15］的测定方法。将5 mL浓度为7 mmol/L的ABTS+溶液和88 μL浓度为140 mmol/L的高硫酸钾溶液混合，室温避光条件下静置过夜形成ABTS+自由基储备液。使用前用无水乙醇将其稀释并在30℃下平衡，直到稀释液在734 nm波长下的吸光度是0.70±0.02，从而形成ABTS+·工作液。此后，通过水浴将样品试液和各试剂溶液温度保持在30℃。然后，取10 mL试管3只，1号试管中加入4 mLABTS+·工作液和40μL乙醇，2号试管中加入4mLABTS+·工作液和40 μL样品试液，3号试管中加入4 mL蒸馏水和40 μL样品试液，充分摇匀后，在30℃下反应30min，然后在734 nm波长下测定各管溶液的吸光度。

样品试液的ABTS+·清除率进行计算：

式中：A0为1号试管溶液的吸光度，Ax为2号试管溶液的吸光度，Ax0为3号试管溶液的吸光度。

1.2.8总抗氧化能力的测定

参照文献［16-17］报道的磷钼络合法测定试样的总抗氧化能力。

在两只10 mL具塞试管中，分别加入4 mL磷钼试剂（该试剂含0.6 mol/L浓硫酸、28 mmol/L磷酸钠和4 mmol/L钼酸铵），然后，在第一只试管中加入0.4 mL样品试液，在第二只试管中加入0.4 mL水，于95℃水浴中恒温保温90 min，然后，以第二只试管里的溶液为空白（调零），于695 nm波长下测定第一支试管溶液的吸光度，以吸光度值直接表示样品试液的总抗氧化能力。

1.2.9还原能力的测定

参照文献［18］报道的普鲁士兰法测定测定试样的还原能力。

取两只10 mL试管，其中1号试管里加入0.5 mL样品试液，2号试管里加入0.5 mL蒸馏水。然后，各管中分别加入0.2 mol/L，pH6.6的磷酸盐缓冲液和1%的K3Fe（CN）6溶液各2.5 mL并混合均匀，于50℃保温20 min后分别再向各管中加入2.5 mL10%的三氯乙酸溶液，混合后以3 000 r/min离心10 min。然后，从1号管中取上清液2.5 mL，转入一洁净的试管（3号试管），同时从2号管中取上清液2.5 mL，转入另一洁净的试管（4号试管），然后并向3、4号试管中各加入2.5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%的FeCl3溶液，混合均匀并静置10 min后，以第二只试管里的溶液为空白（调零），于700 nm波长下测定吸光度。以吸光度值直接表示样品试液的还原能力。

2结果与分析

2.1石榴皮提取物的多酚类物质含量

图1石榴皮分级提取物的多酚类物质含量Fig.1Polyphenols contents of various pomegranate peel extracts

图1展示了石榴皮各级提取物的总酚、单宁和总黄酮的含量测定结果。由它可以看出，石榴皮粗提物经大孔树脂HZ-818纯化后，总多酚、总黄酮和单宁的含量均有很大的提高；大孔树脂纯化物再经乙酸乙酯-水萃取分级，所获得乙酸乙酯相萃取物的总多酚和总黄酮含量进一步提高，而单宁含量的提高较小，所获得水相残留物的总多酚、总黄酮和单宁的含量均低于大孔树脂纯化物。这些试验结果说明大孔树脂纯化和进一步的乙酸乙酯萃取分离，都对纯化石榴皮多酚类物质具有显著效果。

2.2石榴皮提取物的羟基自由基清除能力

石榴皮提取物的羟基自由基清除能力见图2。

图2石榴皮多酚分级提取物的·OH清除能力Fig.2Hydroxyl radical scavenging capacities of various pomegranate peel polyphenol extracts

图2展示了石榴皮各级提取物的羟基自由基清除能力的测定结果。可以看出，各种石榴皮多酚提取物对羟自由基都具有显著的清除作用，且随着样品试液的浓度增大，清除能力增强，表现出良好的量效关系。相比之下，在4 ng/mL浓度以上，它们对·OH的清除效果都比VC更强。而且在大多数试验浓度范围内，随着VC浓度的增大，它对·OH的清除率增长显著慢于这些提取物。就这些提取物相比，它们清除羟基自由基的能力的排序为：乙酸乙酯相萃取物＞树脂纯化物＞水相保留物＞VC＞粗提物。

通常，自由基被清除，其相关活性就失去，所以可以将自由基清除剂对自由基的半数清除浓度看做该清除剂对自由基活性的半数抑制浓度。根据图2中数据，可以计算出，在本文采用的试验条件下，乙酸乙酯相萃取物对羟自由基活性的半抑制浓度IC50为44.13× 10-4mg/mL，树脂纯化物的IC50为49.39×10-4mg/mL，水相保留物的IC50为77.46×10-4mg/mL粗提物的IC50为90.06×10-4mg/mL，而VC的IC50为149.26×10-4mg/mL。

2.3石榴皮提取物的DPPH·清除能力

石榴皮多酚各级提取物清除DPPH·能力测定结果如图3所示。

图3　石榴皮多酚分级提取物的DPPH·清除能力Fig.3DPPH radieal scavenging capacities of various pomegranate peel polyphenol extracts

可以看出，在试验浓度范围内，它们对DPPH·的清除能力均较强，最高约可清除93%的DPPH·。在3.5 ng/mL以下的低浓度范围，剂量效应和相对清除效率显著高于在高浓度范围的。显示石榴皮多酚对DPPH·自由基的清除作用具有良好的量效关系。各样品清除DPPH·的能力基本按以下排序：乙酸乙酯相萃取物＞树脂纯化物＞水相保留物＞VC＞粗提物。

根据图4-3的数据可算得，在本文采用的试验条件下，乙酸乙酯相萃取物对DPPH·活性的半数抑制浓度IC50为13.42×10-4mg/mL，树脂纯化物的IC50为15.91× 10-4mg/mL，水相保留物的IC50为17.82×10-4mg/mL，VC的IC50为22.23×10-4mg/mL，粗提物的IC50为29.85× 10-4mg/mL。

2.4石榴皮提取物的ABTS+自由基清除能力

石榴皮多酚各级提取物清除ABTS+·能力测定结果如图4所示。

图4　石榴皮多酚分级提取物的ABTS+·清除能力Fig.4ABTS+radieal scavenging capacities of various pomegranate peel polyphenol extracts

由它可看出，在所选浓度范围内，这些提取物对ABTS+·的清除能力均很强，除粗提物的最高清除率约85%外，其他三种提取物都可接近全清除。在2 ng/mL以下的低浓度范围，随着这些提取物的浓度增加，清除率迅速而直线升高，在2 ng/mL浓度以上，剂量效应逐渐趋缓。在3.5 ng/mL以下的低浓度范围内比较，四种提取物及VC清除ABTS+·能力的排序为：乙酸乙酯相萃取物＞树脂纯化物＞水相保留物＞VC＞粗提物。

根据图4中的数据可算得，在本文采用的试验条件下，乙酸乙酯相萃取物对ABTS+·活性的半数抑制浓度IC50为7.02×10-4mg/mL，树脂纯化物的IC50为11.61× 10-4mg/mL，水相保留物的IC50为12.16×10-4mg/mL，VC的IC50为12.38×10-4mg/mL，粗提物的IC50为18.13× 10-4mg/mL。

2.5石榴皮提取物的总抗氧化力

石榴皮多酚各级提取物的总抗氧化能力测定结果如图5所示。

图5　石榴皮多酚分级提取物的总抗氧化能力Fig.5Total antioxidatant capacities of various pomegranate peel polyphenols extracts

该图表明：在整个试验浓度范围内，随着提取物样品（和VC）的浓度增加，最终形成的试验液的吸光度基本直线上升，呈现良好的量效关系。这表明这些提取物和VC抗氧化活性在试验范围内稳定地呈现。根据各直线的斜率可知，以此方法测得的各样品的总抗氧化力的强弱顺序为：VC＞乙酸乙酯相萃取物＞树脂纯化物＞水相保留物＞粗提物。

2.6石榴皮提取物的还原能力

石榴皮多酚各级提取物的还原力测定结果如图6所示。

图6　石榴皮多酚分级提取物的还原能力Fig.6Reducing capacity of various pomegranate peel polyphenols extracts

可以看到，各提取物及VC的试液浓度与吸光度呈正比变化，这说明以这些样品的还原能力表现着良好线性的量效关系；以此方法测得的样品还原能力强弱顺序为：乙酸乙酯相萃取物＞树脂纯化物＞VC＞水相保留物＞粗提物。另外，我们可以看到，图6与图5很相似，两图的重要差异只是：在图6里VC的还原力测定曲线介于其他曲线之间，而在图5里VC的总氧化力测定曲线位于其他曲线上方。这是因为，总抗氧化力和还原力测定这两种测定方法的原理都是建立在样品的给电子反应的基础上，但两种方法中电子的受体不同，所以两图基本一致但有所差别是必然的。

2.7石榴皮提取物抑制自由基活性能力的比较

将石榴皮多酚粗提液、树脂纯化物、乙酸乙酯相萃取物、水相保留物以及VC的自由基活性数据转变为图形，就得到图7。

图7　石榴皮多酚抑制自由基能力比较Fig.7Comparison of free radicals scavenging capability of pomegranate peel extract

在该图中，某样品的IC50值越小，表示它的自由基清除能力越强，抑制自由基活性的能力越强。

由图7可知，各种不同的石榴皮多酚分提物对羟自由基、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力均为：乙酸乙酯相萃取物＞树脂纯化物＞水相保留物＞VC＞粗提物。这些石榴皮提取物对ABTS+自由基活性的抑制能力相对最大，对DPPH·自由基活性的抑制能力居中，对·OH自由基活性的抑制能力相对最小。

鉴于羟自由基（·OH）是目前已知的最活泼的和毒性最大的人体自由基之一，它能够进行多种生化反应，导致机体病变和衰老，所以对它的清除剂的研究更值得重视。从图7可知，石榴皮多酚粗提物经过大孔树脂纯化再经乙酸乙酯萃取所得到的制品是相对最有效的羟自由基清除剂。

3结论与讨论

3.1结论

1）石榴皮多酚提取物都拥有较强的清除自由基的能力和抗氧化力。

2）经大孔树脂HZ-818纯化以及经乙酸乙酯萃取后的石榴皮提取物较粗提物具有了更强的清除自由基的能力和抗氧化力。

3）不同分级的石榴皮多酚提取物的总酚含量、总黄酮含量、三种自由基清除能力、总抗氧化力和还原力的排序皆为：其抑制能力为：乙酸乙酯相萃取物＞树脂纯化物＞水相保留物＞粗提物。

4）石榴皮多酚各分级提取物对ABTS+·、DPPH·和·OH的清除能力依次减小。

3.2讨论

本研究结果显示，石榴皮经过醇-水混合溶剂提取得到的粗提物，经大孔树脂HZ-818纯化，再经乙酸乙酯进行萃取分离，总多酚和总黄酮含量不断升高，同时，非酚类化合物的含量不断降低。由于原有多酚、类黄铜和单宁的组分在此过程中差异分配的缘故，粗提物、树脂纯化物、乙酸乙酯想萃取物和水相保留物的酚类化合物的组成也必然有所不同（有待进一步研究证实）。这些基本上构成了它们的三种自由基的清除能力、总抗氧化力和还原力都遵照乙酸乙酯相萃取物＞树脂纯化物＞水相保留物＞粗提物出现这一顺序的本质原因。

本研究结果显示，不论是哪种石榴皮多酚分级提取物，它们对不同自由基的清除能力存在差异，在相同剂量浓度下，它们清除ABTS+·、DPPH·和·OH的能力依次降低，其中原因本文并没专门研究，但从图2、3、4可看出，图2的曲线比图3和图4的更为弯曲和复杂，说明发生在羟基自由基清除试验体系的反应比发生在DPPH和ABTS+自由基清除试验体系的反应更为复杂。这提示我们初步推论：石榴皮多酚提取物与那种自由基的相互反应越复杂，其清除这种自由基的效率就越受可能存在的副反应干扰。这种推论是否合理，有待今后深入研究。

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Comparing Antioxidant Capacities of Pomegranate Peel Extracts in Different Phases

TANG Li-li1，LIU Lin-wei2，ZHU Zhan-bin1
（1.Department of Biological Engineering，Yangling Vocational&Technical College，Yangling 712100，Shaanxi，China；2.College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling 712100，Shaanxi，China）

The in vitro antioxidant capacities of the pomegranate peel polyphenols extracts collected at different separation stages were assayed and compared，with VCbeen as reference.The results showed that.All the extracts had obviously free radicals scavenging activities，which ranked of ABTS+·＞DPPH·＞·OH.From crude extract to resin purification product and then to ethyl acetate extraction phase product，the samples'total polyphenol content and antioxidant capacity values were improved continually.The radical scavenging activities of the different samples were in the order of ethyl acetate phase extract＞resin purification product＞water phase extract＞VC＞crude extract，the total antioxidant capacities of them were in the order of VC＞ethyl acetate phase extract＞resin purification product＞water phase extract＞crude extract，and the reducing capabilityies of them were in the order of ethyl acetate phase extract＞resin purification＞VC＞water phase extract＞crude extract.These results indicate that we can get relatively highest antioxidative pomegranate peel polyphenol extract by coarse extraction，resin purification and ethyl acetate extraction.

pomegranate peel；polyphenol extract；antioxidation capability

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.009

2014-07-18

唐丽丽（1982—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品加工教学与科研。