糜子中还原糖含量测定方法的对比研究

田翔+乔治军+王君杰

摘 要：为了测定糜子中还原糖含量，通过试验建立了3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法。对DNS法中样品前处理的影响因素，如提取液及温度进行了考察，并进行了精密度与回收率试验，测得标准偏差为0.007 7，变异系数为0.011 7，回收率范围85.0%～100%。结果表明，DNS法具有较好的稳定性与灵敏度，可代替国标GB/T 5513—2008铁氰化钾法，适用于试验室糜子还原糖含量的测定。

关键词：糜子；还原糖；铁氰化钾法；比色法；3，5-二硝基水杨酸

中图分类号：S516 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.10.002

Abstract：In order to determine the content of reducing sugar in prosomillet， employed 3， 5-dinitrosalicylic acid （DNS） colorimetric method in this paper. The influence factors of sample pretreatment， such as extract volume and temperature was investigated. Measured the standard deviation was 0.007 7， the variation coefficient was 0.011 7， the values of recovery was in the range of 85.0%～100%. The results showed that the DNS method had good stability and sensitivity， could substitute potassium ferricyanide method in GB/T 5513—2008 and applicable to lab prosomillet determination of reducing sugar content .

Key words：prosomillet；reducing sugar；potassium ferricyanide method；colorimetric method；3， 5-dinitrosalicylic acid （DNS）

糖类是糜子的主要成分，占其干质量的70%～80%。糜子中的还原糖尤以葡萄糖和果糖最为重要。糜子中还原糖含量的测定至今未见报道。谷物中还原糖含量测定的常规方法是铁氰化钾法与斐林试剂法[1-3]。本研究首先用铁氰化钾法对糜子中还原糖含量进行测定。由于比色法测定食品中的还原糖含量具有测定速度快、准确度高等优点，因此得到广泛应用，如砷钼酸比色法和3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法。DNS比色法的基本原理是：3，5-二硝基水杨酸在碱性溶液中被还原糖还原成氨基化合物，在沸水浴中显色5 min后，在530 nm波长下有最大吸收峰。以其吸光度值与溶液还原糖含量成正比为依据，通过标准曲线查得样品浓度。试验对提取剂乙醇用量、提取温度等反应条件进行了优化，建立3，5-二硝基水杨酸比色法测定糜子中还原糖含量[4-8]，以获得可靠的数据为糜子中还原糖含量测定及品质筛选鉴定提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

样品材料：山西省农科院糜子课题提供晋黍1号，晋黍4号，晋黍7号。

1.2 试验试剂

乙醇、乙酸、钨酸钠、铁氰化钾、碳酸钠、氯化钾、硫酸锌、碘化钾、氢氧化钠、淀粉、硫代硫酸钠、葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、亚硫酸钠，以上试剂均为分析纯。

1.3 试验仪器

漩涡混合器（VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器）；电子天平（BSA124S，德国Sartorius）；紫外可见分光光度计（SP-756， 上海光谱仪器）；高速离心机（5804R ， Eppendorf）；恒温水浴锅（HHS， 上海博迅）。

1.4 试验方法

1.4.1 铁氰化钾法 样品溶液的配制：准确称取糜子样品5.675 g，用5 mL乙醇润湿分散，加入50 mL乙酸缓冲液，振荡摇匀，加入2 mL钨酸钠溶液，漩涡混合器上振荡5 min，将混合液在中速定性滤纸上过滤，滤液即为样品液。空白液不加样品，其余操作同上。

在含5 mL样液的试管中加入5 mL铁氰化钾溶液，沸水浴20 min后迅速冷却进行氧化。将氧化操作后的物质倾入100 mL锥形瓶，并用25 mL乙酸盐溶液洗涤试管，一并倾入锥形瓶，加5 mL 10%的碘化钾溶液，立即用0.1 mol·L-1硫代硫酸钠溶液进行滴定至淡黄色后加1 mL淀粉溶液，继续滴定至蓝色消失。空白试验中不含样品，其余操作相同。分别得到V1 与V0，利用公式计算得到铁氰化钾体积，查表对照得到还原糖含量。

1.4.2 3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法 样品处理方法：准确称取糜子样品粉末2.000 g，加 95%乙醇10 mL，60 ℃水浴中提取20 min，其间摇动数次。以12 000 r·min-1离心10 min，上清液备用。

还原糖含量测定：用移液器吸取样液1 mL，加3，5-二硝基水杨酸溶液1 mL，摇匀，置沸水中煮5 min，取出后迅速冷却，加蒸馏水至10 mL，用未加样液的试管作空白，调零，用紫外可见分光光度计在530 nm波长处测定吸光度值。

2 结果与分析

2.1 铁氰化钾法

2.1.1 还原糖含量的计算 氧化样品液中还原糖消耗0.1 mol·L-1铁氰化钾溶液体积（V3）的计算公式：

式中，V0为滴定空白样液消耗0.1 mol·L-1硫代硫酸钠溶液的体积；V1为滴定样品液消耗0.1 mol·L-1硫代硫酸钠溶液的体积，单位均为mL。根据GB/T 5513—2008表A.1可查得0.1 mol·L-1铁氰化钾体积对应的还原糖含量[1]。

按照同样方法平行操作两次，测定结果求平均值，结果见表1。

2.2 3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法

2.2.1 3，5-二硝基水杨酸比色法标准工作曲线 绘制葡萄糖标准曲线：配制一系列含不同浓度葡萄糖的溶液，加1 mL 3，5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴5 min，取出迅速冷却并加水定容至10 mL。显色15 min后测定530 nm处吸光度值。

根据葡萄糖含量与吸光度值绘制标准工作曲线，见图1。如图1所示，葡萄糖含量与吸光度值有较好的线性关系，y=1.710 7x-0.055 9，相关系数R2=0.998 6。所以可以利用3，5-二硝基水杨酸比色法进行样品中还原糖的测定。

2.2.2 还原糖含量计算公式 还原糖（以葡萄糖计）=（葡萄糖毫克数×稀释倍数×提取体积）/（样品质量×1 000 ×显色体积） ×100%。

2.2.3 优化样品处理条件 样品处理过程中乙醇用量对糜子中还原糖的提取率影响较大，因此分别考察了不同料液质量比（样品∶乙醇）情况下还原糖含量测定结果，见表2。由图2可知，当样品与乙醇的质量比为1∶5时糜子中还原糖的提取较完全。

水浴温度同样对还原糖测定结果产生影响，因此确定样品与乙醇的质量比为1∶5，分别测定水浴温度为60，70，80，90，100 ℃时晋7号糜子的还原糖含量。由图2可知，温度为60 ℃提取率最大，温度过高导致还原糖含量测定结果偏低，因此选择60 ℃作为提取温度。

2.2.4 在优化条件下测定样品 称取样品2 g，加入乙醇提取液10 mL，提取还原糖的水浴温度为60 ℃，利用3，5-二硝基水杨酸比色法分别测定晋黍1号、晋黍4号、晋黍7号样品中还原糖含量，根据计算公式得到三者的还原糖含量分别为0.59%，0.88%，0.66%。

2.2.5 精密度试验 在优化条件下对晋黍7号样品进行测定，重复6次，得出平均值，计算标准偏差值和变异系数，考察方法的精密度。如表3所示，计算得到平均值为0.66%，标准偏差为0.007 7，变异系数为0.011 7，可见该法用于还原糖测定具有较好的精密度[9-15]。

2.2.6 回收率试验 采用标准加入法，在1 mL已知含量的样品液中分别加入0.02，0.04，0.1 mg 0.1% 的标准葡萄糖溶液，测定回收率，结果见表4。

回收率=（加标测定值-试样测定值）/加标量×100%

3 结 论

试验结果表明，GB/T 5513—2008中铁氰化钾法和3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法均适用于糜子中的还原糖含量测定。用铁氰化钾法测得晋黍1号、晋黍4号、晋黍7号中的还原糖含量分别为0.71%，0.8%，0.76%，滴定操作较为简便，但准确性较差。用DNS 法测得的含量值分别为0.59%，0.88%，0.66%，计算标准偏差为0.007 7，变异系数为0.011 7，回收率范围85.0%～100%，DNS法测定还原糖含量稳定性与准确度高。

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