黑曲霉液态发酵制备没食子酸的工艺研究

熊进　何顺荣　吴鑫颖　邱树毅　简辉　马威

摘要：采用高效液相色谱测定黑曲霉B0201制备的没食子酸，对底物添加方式、底物浓度、转化方式及转化条件等因素进行研究。最终确定较佳工艺条件为：用五倍子直接作为产酶的诱导物及转化底物，底物分4次添加，每次间隔12h，最终总浓度达6%，转化过程中搅拌速度优化为200r/min，温度为35℃，没食子酸浓度可达到39.78mg/mL，转化率达最大值73.05%。在对菌丝重复转化试验过程中补加营养物质及调节pH值均能提高转化产物浓度。

关键词：黑曲霉；液态发酵；五倍子；生物转化；没食子酸；工艺优化

中图分类号：TQ920.1 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0250-04

没食子酸（gallicacid，GA）又名五倍子酸，为白色或淡黄色针状结晶，化学性质活泼，能形成多种酯类、酰卤和酰胺，可以通过氧化耦合反应制得鞣花酸、脱氢二鞣花酸等联苯型化合物，是一种重要的精细化学品，广泛应用于矿产、化工、农业、食品、制药等行业。目前，没食子酸的制备方法可分为化学法与生物法，工业上没食子酸主要是由化学法经酸或碱水解五倍子制得，其工艺存在对环境污染严重、副反应多、杂质含量较高等问题。而生物法因具有反应条件相对温和、对设备要求低、副产物较少、对环境友好以及岳续提纯工艺较为简单等诸多优点，近年来受到国内外相关学者的广泛关注。五倍子富含单宁酸，研究表明单宁酸诱导黑曲霉液态发酵产胞内单宁酶，单宁酶可高效、专一、定向裂解单宁酸分子，生成没食子酸；故直接将五倍子投入发酵系统中，利用菌体内的单宁酶将之转化为没食子酸。当转化趋于平衡后，分离菌丝体并洗涤，可反复转化五倍子制备没食子酸。此过程不需要将酶从菌体中分离，将酶的生成与五倍子单宁酸转化没食子酸的过程相耦合，简化了没食子酸的生物转化过程。与酶法转化相比，此方法转化底物浓度有很大倍数的提高，产物浓度也有很大提高。同时，分光光度法与高效液相色谱法相比，测定没食子酸是前者由于单宁酸和没食子酸结构相近，最大吸收峰波长也较近产生累加效应，因此产生的干扰比较大，实际测量值会偏大。本试验通过对底物添加方式、底物浓度、转化方式及转化条件等因素进行研究，以提高没食子酸相对于五倍子中单宁酸的转化率，为生物法制备没食子酸的工业化应用奠定基础。

1.材料与方法

1.1试验材料与仪器

1.1.1菌株黑曲霉B0201（Aspergillusniger），由笔者所在实验室保藏。

1.1.2培养基斜面培养基：察氏培养基；液态基础培养基：蔗糖2.0g，NaNO30.2g，K2HPO4·3H2O0.1g，KCl0.05g，MgSO4·7H2O0.05g，FeSO4·7H2O0.001g，溶于100mL蒸馏水中，pH值自然。

1.1.3主要试剂五倍子，购于贵州省遵义市余庆县；单宁酸C76H52O46，分析纯，购于天津福晨化学试剂厂；没食子酸C7H6O5·H2O，分析纯，购于贵州迪大生物有限公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.1.4主要试验仪器722S分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；FA-1004电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；MJ-160B-II霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；Anke TDL-5离心机（上海安亭科学仪器厂）；XMTD-204双功能蒸汽振荡器（金坛市文华仪器制造有限公司）；岛津LC-10AVP高效液相色谱仪（岛津有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1产酶

1.2.1.1菌种的活化将保存的黑曲霉B0201转接到察氏斜面培养基后，放入霉菌培养箱中，于30℃条件下培养3～4d后，保存备用。

1.2.1.2种子悬浮液的制备斜面试管加入10mL生理盐水，洗脱并充分振荡、稀释后获得10⁸个/mL左右的孢子悬浮液。

1.2.1.3黑曲霉B0201发酵产酶在灭菌的液态基础培养基中添加4%的五倍子，接种量2%，装液量100mL/250mL，摇匀后用纱布封口置于140r/min、30℃的摇床中培养72h，完成发酵产酶过程。

1.2.2没食子酸的制备

在产酶系统中直接添加底物转化五倍子单宁酸制备没食子酸。

1.2.3单宁酸转化率的测定

1.2.3.1没食子酸相对于单宁酸的转化率计算

1.2.3.2

单宁酸的测定

参考国家标准GB/T15686-1995，用紫外分光光度法测定单宁酸含量。（1）单宁酸标准曲线的绘制。配制不同浓度的标准溶液，再加入2.0mL磷钼钨酸试液和10.0mL饱和碳酸钠溶液，定容到50mL，静置30min后于4000r/min离心5min，720nm下光谱扫描。以吸收峰值D为纵坐标，样品浓度C（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：D=1.325C+0.113，r=0.9990。（2）五倍子中单宁酸含量的测定。取10.0g五倍子于三角瓶中，按1：12的比例加入蒸馏水，于140r/min、40℃下振荡浸提，每隔12h，取少量浸提液，过滤后按照单宁酸的测定方法测定其含量，最后计算五倍子中单宁酸总的浸出量。

1.2.3.3没食子酸的测定

（1）液相色谱条件。色谱柱为Waters Symnletryc18（5μm，4.6mm×150mm）；流动相：A相甲醇（85%），B相0.5%乙酸溶液（15%）；检测波长：273nm；柱温：40℃；流速：0.8mL/min。（2）没食子酸标准曲线的绘制。配制不同浓度的标准溶液，在上述液相色谱条件下，各进样20μL，平行测定5次。以峰面积A为纵坐标，样品浓度c（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=65453.13C-163771.09，r=0.9998。说明没食子酸在0.0506～O.406μ/mL范围内有良好的线性关系。（3）样品中没食子酸含量的测定。取1mL样品滤液，稀释到适当倍数，在上述液相色谱条件下进样20μL，平行测定5次，根据回归方程计算没食子酸的平均含量。

2.结果与分析

2.1单宁酸浸提率与浸提时间的关系

按照五倍子中单宁酸含量的测定方法，所得到单宁酸的浸提率（浸提液中单宁酸的生成量与五倍子的添加量的比值）与浸提时间的关系见图l。由图1看出，随着浸提时间的不断延长，单宁酸不断从五倍子中浸提出来，浸提时间72h时，浸提率达到55%，之后浸提率达到平稳。这说明单宁酸随浸提时间的延长，不断从五倍子中浸提出来，最终达到稳定值55%左右。单宁酸的浸提曲线可以反映实际可利用的单宁酸量，故可为单宁酸转化率的计算提供依据。

2.2不同转化方式对转化率的影响

转化方式分2种：（1）将产酶菌丝分离，并用蒸馏水反复洗涤后，转入100mL含4%五倍子的溶液中，140r/min、30℃条件下转化，一定时间后测定转化液中没食子酸含量。（2）直接在发酵产酶系统中补加4%的五倍子，140r/min、30℃条件下继续转化，测定转化液中没食子酸的含量。按不同的转化方式，在120h和170h时没食子酸含量见表1。从表1可以看出，用相同量的诱导物和转化底物，转化120h和170h时菌丝球转化产物总质量分别为3.5537、3.2943g，而直接转化产物总质量分别为3.6598、3.3888g。2种转化方式所得到的没食子酸总质量差别不大。故从节省操作工序的角度考虑，选择直接添加五倍子粉转化的方式。

2.3不同的诱导物、底物形式对转化率的影响

分别在液态基础培养基加入4%五倍子和2%单宁酸（相当于4%的五倍子中单宁酸量），培菌产酶结束后，再分别在相应的培养基中添加4%五倍子和2%单宁酸作为底物，于140r/min、30℃条件下转化，然后每隔8h测定转化液中没食子酸的含量，结果见图2。由图2看出，利用五倍子作为诱导物和底物时，转化到120h时趋于平衡，转化率可以达到73%以上；而利用单宁酸作为诱导物和底物时，刚开始得率相对较高，转化到90h时，转化趋于平衡，转化率为63.5%，平衡时用五倍子转化转化率明显偏高。这可能是由于用单宁酸转化时底物与酶结合空间阻碍小，转化速度快，其先达到底物饱和浓度，过量的单宁酸又会抑制产物的生成；而用五倍子作为底物时单宁酸是缓慢浸提出来的，前期转化速度慢，且低浓度的底物不会产生抑制效应，一定时间后才会达到饱和浓度，同时也能减少单宁酸制备过程。故选用五倍子作为诱导物和底物。

2.4底物添加方式对转化率的影响

培菌产酶结束后，采用分批补料方式，在上述相同的转化条件下转化，在转化过程中每隔12h添加2.0%的五倍子，与在相同的转化时间内一次性补料添加相同量的五倍子对照，2种底物的添加方式对没食子酸生产的影响情况见图3。在分批添加底物的过程中，pH值的变化情况见图4。由图3和图4可以看出，对于相同的转化时间分批补料有利于提高没食子酸的产量，随着转化时间延长，没食子酸浓度增大，最高达43.85mg/mL；但转化率先增大后降低，浓度最大时转化率只有56.95%，且pH值不断降低，最后都趋于稳定。这可能是因为分批补料有利于底物的持续供给，有利于转化，且pH值的下降可能对酶活起抑制作用，不利于转化。故分批补料对转化起积极作用；需在转化过程中加强调节pH值，以利于酶的稳定及作用的发挥。

2.5底物分批添加累积浓度对转化率的影响

培菌产酶结束后，按每隔12h分别添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的五倍子底物，共添加4次，考察五倍子累积添加量分别为4.0%、6.0%、8.0%、10.0%时对没食子酸产量的影响，不同底物浓度对产物浓度及转化率的影响见图5和图6。由图5和图6可以看出，随着底物浓度增大，没食子酸浓度从32.29mg/mL增加到41.46mg/mL；转化率从75.64%降低到58.56%。底物浓度累积量为4%和6%时，两者转化率相差不大，但后者没食子酸浓度较前者高出很多，最大浓度为39.78mg/mL时，转化率为73.05%。故选择最佳终浓度为6%，添加4次，每次1.5%，浓度为39.78mg/mL时，转化率为73.05%。

2.6转化条件对转化率的影响

培菌产酶结束后，在分批补料的条件下，转化过程中采用不同的转速140、160、180、200、220r/min，对没食子酸的影响见图7；采用不同的转化温度25、30、35、40、45℃，对没食子酸产量的影响见图8。由图7可知，随着转速提高，转化率先增加后降低，当达到200r/min时转化率达到最大值。主要原因可能是转速直接影响发酵环境均匀性，转速太小，原料沉降与菌体分离，酶与底物结合空间受阻碍不利于转化；转速过大，对菌丝的剪切力较大，损伤菌丝，不利于菌丝的稳定生长及产酶。故200r/min是最佳的转化转速。由图8可知，温度对转化率的影响不显著，在30～40℃均有较高的转化率。温度对转化率的影响主要体现在2个方面：其一可能是温度升高时有利于单宁酸的提取溶出；其二酶是具有生物活性的大分子，在酶的最适作用的温度范围内，较高温度有利于提高酶反应速度。故选用35℃作为转化温度。

2.7菌丝转化次数对转化率的影响

培菌产酶结束后，按上述优化条件进行第一次转化结束后，即最后一次投料后继续转化12h，将菌丝球分离洗涤，重新按上述方法添加五倍子粉重复4次转化试验；并直接将菌丝转移到含有50%剂量的察氏培养基中添加五倍子粉进行转化或用稀氨水调节pH值，使之维持在4.5左右的方式来考察对转化率的影响，其转化情况见表2。由表2可以看出，随着转化次数的增加，相同的底物所得到的没食子酸的浓度越来越低。这可能是由于洗涤过程中导致酶的损失，使酶量减少，导致转化率不断下降。同时可以看出，添加少量的营养物质和调节pH值条件下没食子酸的浓度都比对照高。这可能是因为转化过程中更换发酵培养基，菌体环境变化，补充营养物质有利于维持菌体活性，保证酶活；随着没食子酸的不断积累pH值下降，添加氨水保证了酶作用的pH值，提高了酶活，同时也为菌体补充氮源，从而提高了转化率，且效果比单纯添加营养物质的好。故在对菌丝重复转化试验过程中补加营养物质及调节pH值使转化产物浓度均有所提高。

3.结论

目前，有关生物法制备没食子酸的报道，国内外都取得了一定的进展。杨亚力等以五倍子为底物用黑曲霉进行转化试验，其发酵液中没食子酸累积浓度达到25.6mg/mL，以五倍子中提取物单宁酸来计算没食子酸相对转化率为51.1%；Beena等报道了以单宁酸作为诱导物，利用菌株（AspergillusawamonBTMFW032）进行深层液态发酵，通过发酵84h，没食子酸的浓度可以达到372.6μg/mL；Seth等以单宁酸作为底物，利用Aspergillusawamoni，持续发酵60h，没食子酸的浓度可以达到19g/L，发酵作用100h左右，所积累的没食子酸浓度达到最大，为40.3g/L。

本试验利用黑曲霉B0201菌株产单宁酶，研究在不同条件下转化五倍子制备没食子酸，最终确定液态发酵产酶转化没食子酸的工艺条件为：采用不分离菌体直接转化方式，将五倍子作为产酶的诱导物及转化底物，采用分批补料方式，分4次添加，每次间隔12h，底物累积浓度6%，转化过程搅拌速度为200r/rain，转化温度为35℃，该试验在转化液中没食子酸浓度达到39.78mg/mL时，没食子酸相对于单宁酸的得率达到最高（73.05%），与以上报道的相比，在现有的报道中最高。但菌丝连续多次转化后转化能力下降，添加少量营养物质和调节pH值对菌丝球重复转化起积极作用，调节pH值的积极转化效果比添加少量营养物质的转化效果明显。