李红梅,张素文,朱肖杰,郈秀菊,孟建文,王晓晨,朱小敏
(山东省药学科学院, 山东省医用高分子材料重点实验室,济南 250101)
透明质酸(HA)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单元重复连接组成的一种链状聚阴离子粘多糖[1],是人和动物皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分。高纯度的注射级HA已被制成注射剂,用于眼科手术、骨科手术、预防术后粘连、治疗骨性关节炎和类风湿性关节炎[2]。此外,也被用于面部注射美容,改进皮肤外观和结构、减轻皱纹、阻止皮肤衰老或改进唇部形状[3-4]。HA具有良好的生物相容性,极少产生副作用,但由于它在体内降解太快,难以维持理想效果。近年来,透明质酸经修饰或交联后获得了一些毒性小、生物相容性好的抗降解产物,陆续被开发为多种面部注射美容产品[5]。目前,国外最热销的美容产品PERLAN和RESTYLANE(瑞典Q-MED公司)即属该类交联产品;国内近几年已有同类产品生产和上市,如华熙福瑞达生物医药有限公司的润百颜,上海其胜生物制剂有限公司的海薇,北京爱美客生物科技有限公司的逸美,科妍生物科技股份有限公司(台湾)的水微晶等。
我们研制的交联透明质酸钠凝胶主要用于注射美容,因在制备过程中使用了异丙醇。故应严格控制异丙醇的残留量。本试验采用气相色谱法测定交联透明质酸钠凝胶中异丙醇的残留量[6]。
气相色谱仪(检测器:Agilent6897,顶空自动进样装置:Agilent7697A,美国Agilent);氢火焰离子化检测器;电子分析天平(上海精密电子分析天平JA003N)。
异丙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,≥99.7%);交联透明质酸钠凝胶(自制,批号:20140806、20140809、20140811)。
安捷伦DB-624(30 mX0.535 mmX3.0 μm)毛细管柱;进样口温度180℃,分流比10:1;检测器温度为180℃;载气为氮气,流速为2.0 mL/min,氢气流速为2.0 mL/min;柱温采用程序升温,初始温度为50℃,保持1 min,以10℃/min升温至160℃,后运行温度:50℃,保持1min。顶空自动进样装置,加热箱温度为80℃,定量环温度为90℃,传输线温度为100℃;样品平衡时间为30 min。进样量为1 ml。色谱图见图1(保留时间Rt=6.212)。
图1异丙醇的色谱图
Fig1Chromatographyofisopropanol
取色谱纯异丙醇适量置于容量瓶中,精密称定,用纯化水稀释至刻度,摇匀,制成每1 ml含10.83 mg的对照品储备液。
精密量取对照品储备液1 ml于100、50、25 ml容量瓶中,加水至刻度,作为2、3、4号标准溶液;精密量取对照品储备液2 ml于25 ml容量瓶中,加水至刻度,作为5号标准溶液;于2号标准溶液中精密量取10 ml于100 ml容量瓶中,加水至刻度,作为1号标准溶液。各精密量取4 ml分别加入10 ml的顶空瓶中,密封,放入顶空自动进样装置中,按3.1条件进样,记录峰面积。以异丙醇峰面积为纵坐标,浓度为横坐标进行线性回归,求得线性回归方程为:
A=1701.2C+20.101
R=0.9990
由上可知,浓度在0.01083~0.8664 μg/mL范围内与各自峰面积线性关系良好。
取3号异丙醇标准溶液,按3.1条件连续进针6次,测得异丙醇的峰面积的RSD为 2.9% 。精密度良好。
取3号异丙醇标准溶液,按3.1条件于0、2、4、6、8 h进行测定,测得异丙醇的峰面积的RSD为3.0%。
取3.3项下1号异丙醇标准溶液进行稀释,每一次稀释,取样进样,要求:S/N≥3,测得异丙醇的最小检测限为0.060μg/mL。
称取交联透明质酸钠凝胶9份,每份2 g,精密称定,加入到10 ml顶空瓶中,每三份分别加入适量浓度的异丙醇溶液2 ml,摇匀,密封,放入顶空自动进样装置中,按3.1条件进样测定,计算异丙醇的平均回收率 99.1%,RSD为1.2%。
取各批号交联透明质酸钠凝胶2 g ,精密称定,置10 ml顶空瓶中,准确加人纯化水2.0 ml,混合均匀。另精密量取异丙醇标准溶液各4.0 ml,置10 ml顶空瓶中,摇匀,密封,放入顶空自动进样装置中,按3.1条件进样测定,记录峰面积;按外标法以峰面积计算。交联透明质酸钠凝胶的异丙醇残留为分别为24.49、24.12、25.08 μg/g。色谱图见图2。
图2样品的色谱图
Fig2Chromatographyofsample
异丙醇沸点为82℃,易溶于水,挥发性好,也容易气化,可直接采用顶空气相色谱法进行测定。潘华先等[7]采用气相色谱法测定医用透明质酸钠凝胶中乙醇残留量,样品制备中密封后放入80℃恒温干燥箱中平衡20 min,直接进样。《YY0308-2004 医用透明质酸钠凝胶》行业标准中样品制备也是密封后放入80℃恒温干燥箱中平衡20 min,直接进样。参照乙醇残留量值为应不大于400 μg/g的要求[8],将交联透明质酸钠凝胶中异丙醇的残留量定为其值应不大于400 μg/g。
本试验建立了一种简单、快速、准确的交联透明质酸钠凝胶中异丙醇残留量的测定方法,精密度在3.0%以下,最小检测限为0.060μg/mL,浓度在0.01083~0.8664 μg/mL范围内,与各自峰面积线性关系良好。测定的交联透明质酸钠凝胶中异丙醇残留量符合要求。
综上所述,通过顶空气相色谱分析法,在本研究中确定的色谱条件下,可以快速、准确地分析交联透明质酸钠凝胶中异丙醇的残留量。