铁棒锤提取物对常见肠道致病菌体外抑制作用

董开忠，　傅思武，　杨世英，　米友军，　苏 露

（西北民族大学医学院，甘肃　兰州　730030）

铁棒锤提取物对常见肠道致病菌体外抑制作用

董开忠，傅思武，杨世英，米友军，苏 露

（西北民族大学医学院，甘肃兰州730030）

目的 探索铁棒锤提取物对肠道致病菌的体外抑制作用。方法 应用水和醇两种溶剂并辅助超声波提取法，采用琼脂扩散法测定提取物的抑菌性，并通过光谱法和倍比稀释法测定对肠道致病菌的最小抑菌质量浓度（MIC）以及最小杀菌质量浓度（MBC）。结果 铁棒锤超声水提物抑菌圈与超声波醇提物相比有统计学意义（P＜0.05），对7种肠道致病菌抑菌性随药物浓度的增加差异有显著性（P＜0.01），且MIC在12.5～20 mg/mL范围内。结论 铁棒锤水提取物对细菌性肠道致病菌在体外有较好的抑制作用。

藏药；铁棒锤；肠道致病菌；抑菌作用

藏药铁棒锤Aconitum pendulum Busch属毛莨科乌头属草本植物，主要生长在高海拔（3 300～4 900 m）地区。是藏族习用药之一，名为榜阿那保，具有清热解毒，祛风除湿，消肿止痛、活血祛瘀等药理活性［1］。主要用于风湿性关节炎、关节痛、跌打瘀痛、黄水病，麻风，癫狂，肿瘤等疾病的治疗［2］。该植物长期处于强日照、大温差、高寒缺氧的特殊环境造就了特有的次生代谢产物，这些产物往往是新药开发的潜在先导化合物［3］。

目前国内外对铁棒锤的研究主要是成分分离鉴定，经串联质谱分析其根部的5个主要生物碱成分为12-表-欧乌头碱、3-脱氧乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱-8-亚油酸酯和乌头碱-8-亚油酸酯［4-5］；其中部分生物碱具有杀虫［6］和对小鼠的毒杀活性［7］；段径云等用铁棒锤水提浸膏对小鼠移植瘤［S180（多形细胞性肉瘤），H22（肝细胞瘤）和S37（未分化肉瘤）］有明显抑制作用［8］。目前对藏药的药理研究报道较少，尚无铁棒锤体外抑菌作用的研究，为了探讨藏药铁棒锤发挥药理作用的机理，本实验旨在探索藏药铁棒锤抑菌物质提取工艺及对常见肠道致病菌的抑菌作用，明确铁棒锤对消化道感染细菌的抑菌作用特点，为民族医药藏药研究开发提供基础数据。

1　材料与方法

1.1实验菌种 金黄色葡萄球菌Staphylococcu aureaus（ATCC25923）、大肠埃希菌Escherichia coli（ATCC25922）、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（ATCC6633）、伤寒沙门氏菌Salmonella typhi（CMCC50071）、宋内氏痢疾杆菌Shigella sonnei（ATCC25931）、变形杆菌Proteus（ATCC13315）、产气杆菌Aerobacter aerogenes（ATCC13049）和粪肠球菌Enterococcus faecalis（ATCC29212），均由本院医学中心实验室保存。

1.2实验药品 实验用铁棒锤采自甘肃天祝藏族自治县乌鞘岭山脉，经天祝藏族自治县藏医药研究所秦宁恩加研究员鉴定为藏药铁棒锤，新鲜带回实验室，洗净进行提取。

1.3仪器及试剂 实验仪器为立式高压蒸汽灭菌器（YXLS-100S2上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；摇床（ZHWY200B上海智城分析仪器制造有限公司）；数显恒温培养箱（HPX-9272MBE上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DL-4000B冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂产品）；电子天平（CP124S sartious）；生物安全柜（HFsafe-1200 Hea1 Force）；紫外分光光度计（1810DSPC北京普析通用仪器有限责任公司）。

营养琼脂（批号20110309-01）及营养肉汤（批号20110215-01）由杭州微生物试剂有限公司提供，无水乙醇、二甲基亚砜（DMSO）等试剂均为分析纯。

1.4铁棒锤水提物和醇提物的制备 取新鲜铁棒锤200 g，剪碎用研钵研磨，并均分4份，1份按料液比1∶10（g/mL）加入适量去离子水，浸泡30 min后，超声提取1 h，6 000 r/min，离心15 min，取上清采用醇沉淀除去叶绿素、蛋白质等，获得铁棒锤水提物。另取3份按料液比1∶10（g/m L）加入适量不同比例乙醇（50%、70%和95%），浸泡30 min后，超声提取1 h，6 000 r/min，离心15 min，即得铁棒锤醇提物。真空干燥得褐黄色浸膏，用DMSO溶解，终质量浓度为500 mg/mL，通过0.22μm无菌滤器除菌，储存于4℃冰箱备用。

1.5菌液的制备及浊度测定 取受试菌接种至平板，37℃恒温培养16～24 h后，经染色镜检挑取典型菌落接种于营养肉汤中，37℃培养18 h，以无菌生理盐水10倍逐次稀释菌液，并检测各浓度菌液对应的OD600值［9］，选择相当于0.5倍麦氏标准比浊管菌液浓度作为试验用浓度。

1.6琼脂扩散法测定不同提取物的抑菌效果［10-11］取受试菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌菌液0.2mL加入平皿，无菌涂布棒均匀涂布于营养琼脂表面，用直径6mm无菌打孔器规则打孔，各孔加入100μL（50 mg/mL）药液，以硫酸阿米卡星（0.04mg/mL）作为阳性对照，DMSO为阴性对照，将平皿置于恒温培养箱37℃培养18～24h后观察并测定抑菌圈的直径，分析不同提取物的抑菌效果。

1.7热稳定性测试 将定容至50mg/mL铁棒锤水提取物分别在60、80、100、120℃加热处理30min，未进行热处理的相同质量浓度的提取物为对照，以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌为受试菌，采用琼脂扩散法测定抑菌活性。

1.8水提物对肠道致病菌的抑菌作用 应用分光光度法选择OD600值为标准数据，以营养肉汤为对照校准为零，将7种所测试肠道菌接种至营养肉汤培养基，置37℃恒温培养16h测OD600值；同法接菌至营养肉汤后分别加入不同质量浓度提取物（0.5、1.0、2.0、4mg/mL）培养后测OD600值。

1.9最小抑菌质量浓度（MIC）及最小杀菌质量浓度（MBC）的测定 采用对倍稀释法测定铁棒锤水提取物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、宋内氏痢疾杆菌、粪肠球菌、产气杆菌和变形杆菌的MIC［12］，依次在试管中加入培养基对倍稀释的药物0.5mL，各管中药物的终质量浓度为0.05～100.00mg/mL，每管中加入菌液0.1mL混匀，置37℃恒温培养24h，测定各管OD600值，以无细菌生长管所含最低药物质量浓度为最小抑菌质量浓度。以不加药物（仅加培养基和菌液）管为细菌生长对照管。依据文献［13］取0.1mL未见细菌生长的各管培养物涂布于平板，置37℃恒温培养24h，进行菌落计数，以菌落数小于5的最低药物质量浓度为最小杀菌质量浓度（MBC）。

1.10统计学方法 采用SPSS11.5统计软件分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，组间比较用t检验，多组间比较用方差分析。

2　结果

2.1铁棒锤水提物和醇提物的结果 经两种溶剂并辅助超声波提取均获得褐黄色浸膏，且水的提取率为35%，醇的提取率为52%，醇的提取率明显高于水，随着醇体积分数增加浸膏提取率基本相同。

2.2菌液浓度比浊度的测定 波长600nm处以分光光度计测得相当于0.5倍麦氏比浊管浊度的菌液OD值为0.09，在浓度为1.5×103cfu/mL～1.5×108cfu/mL范围内，随着菌液浓度的增加，OD600值增加，两者间存在线性关系。且经反复测试所有受试菌在第16小时均达到最大菌浓度，此时测量的光密度均为最大值。

2.3两种溶剂提取物的抑菌效果分析 分别以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌为受试菌，应用琼脂扩散法测试提取物抑菌作用，结果显示水提物对3种受试菌的抑菌圈明显大于醇提物，而醇提取物抑菌圈大小随乙醇体积分数的提高越来越小。3种受试菌分别为G+、G-和芽孢菌，依据抑菌结果分析水提物可能具有广谱抑菌性。结果见表1。

表1　铁棒锤水、醇提取物的抑菌效果比较（±s，n=9）

表1　铁棒锤水、醇提取物的抑菌效果比较（±s，n=9）

注：与阴性对照组比较，**P＜0.01

不同提取物抑菌圈直径/mm枯草芽孢杆菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌阴性对照组000阳性对照组18±0.2326±0.4222±0.31水提物15±0.57**22±1.34**18±1.19**50%醇提物10±0.63**14±0.48**11±0.59**70%醇提物8±0.349±0.369±0.63 95%醇提物7±0.438±0.217±0.24

2.4热稳定性测定分析 水提取物经不同温度加热处理后，进行抑菌作用测定，两种受试菌抑菌圈大小与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），可初步表明温度对铁棒锤抑菌活性没有影响，热稳定性好，具有很好的耐热性。结果见表2。

表2　铁棒锤水提取物热稳定性测试（±s，n=9）

表2　铁棒锤水提取物热稳定性测试（±s，n=9）

注：与阴性对照组比较，*P＞0.05

温度抑菌圈直径/mm大肠埃希菌金黄色葡萄球菌阴性对照组22±1.3418±1.19 60℃22±0.68*18±0.63*80℃22±0.46*18±0.56*100℃22±0.52*18±0.38*120℃22±0.39*18±0.43*

2.5铁棒锤提取物对7种细菌的抑制作用 应用分光光度法测不同质量浓度水提取物对7种常见肠道致病菌的OD600值，结果与对照组比较质量浓度为0.5、1.0mg/mL的P＜0.05，2.0、4.0mg/mL的P＜0.01，且随药物质量浓度增加7种受试菌的OD值均不同程度减小，说明药物对7种受试菌的增殖有明显的抑制作用，同时对革兰氏阳性、阴性菌都有抑制作用。结果见表3。

2.6受试菌对铁棒锤提取物MIC及MBC的测定结果 置37℃恒温培养24h，以无细菌生长管所含最低药物质量浓度即为MIC，依据文献［13］以菌落数小于5的最低药物质量浓度为MBC，结果见表4和表5。

3　讨论

随着临床抗感染性疾病抗生素剂量的增加，细菌耐药性不断增加，耐药成为全球性公共健康问题［14］，于是探寻并开发有效的抗菌药物目前成为国内外抗感染研究的趋势和热点［15］。藏医药学是我国传统医药学宝库中的瑰宝，具有悠久的历史和丰富的蕴藏，它是当今世界上独具特色的民族医药学体系。取材于高原地区的植物药材长期生存于高海拔、强日照、大温差、高寒缺氧的高原地理环境，孕育了多种特有的次生代谢产物，这将是新药开发的潜在先导化合物，是抗菌药物研究和开发的新生方向，具有广阔的应用前景。

表3　不同质量浓度铁棒锤水提取物对肠道病原菌的抑制作用（±s，n=9）

表3　不同质量浓度铁棒锤水提取物对肠道病原菌的抑制作用（±s，n=9）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

菌株OD600值阴性对照组提取物质量浓度/（mg·mL-1）0.51.02.04.0宋内氏痢疾杆菌1.079±0.0150.939±0.021*0.685±0.023*0.425±0.016**0.276±0.018**伤寒沙门氏菌1.034±0.0180.882±0.022*0.607±0.024*0.490±0.019**0.202±0.024**产气杆菌1.294±0.0211.057±0.017*0.736±0.026*0.490±0.018**0.198±0.017**大肠埃希菌1.341±0.0230.925±0.021*0.622±0.013*0.384±0.021**0.135±0.019**粪肠球菌0.990±0.0170.705±0.022*0.623±0.019*0.439±0.015**0.236±0.023**变形杆菌1.714±0.0211.199±0.019*0.997±0.018*0.738±0.023**0.423±0.018**金黄色葡萄球菌1.533±0.0190.879±0.023*0.612±0.029*0.436±0.025**0.278±0.021**

表4　铁棒锤水提物MIC测定（n=9）

表5　铁棒锤水提物MBC测定（n=9）

有关铁棒锤活性物质提取的方法目前文献资料显示为传统煎煮法和乙醇浸渍法萃取，而本实验应用水和不同比例的乙醇做为溶剂并借助超声波萃取，结果显示超声波水提抗菌物质效果明显优于超声波醇提，而超声波醇提取随着醇体积分数的增加提取效果越来越差，这说明抗菌有效成分为水溶性。经反复试验超声波水提法是一种操作简单、萃取工艺成本低、综合经济效益显著的方法。

本实验首次从其清热解毒的药理作用方面对藏药铁棒锤进行体外抑制常见肠道致病菌活性研究，结果表明铁棒锤显著抑制大肠埃希菌、变形杆菌、宋内氏痢疾杆菌、产气杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的增殖，这表明铁棒锤具有广谱抗菌作用。且对以大肠埃希菌、变形杆菌、宋内氏痢疾杆菌、产气杆菌、伤寒沙门氏菌为代表的G-的抑制效应比以金黄色葡萄球菌和粪肠球菌为代表的G+显著，并在质量浓度与抑菌效应呈正相关，此差异性与G+和G-菌的细胞壁结构及化学组成不同有关［16］。应用超过标准大气压103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸汽压下，温度达到121.3℃处理30min仍具有较好的抑菌性，说明该抗菌成分热稳定性好，此特性明显优于目前临床常用的来源于细菌、真菌和放线菌的抗菌药物，可以通过高压蒸汽灭菌处理后包装。

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R285.5

B

1001-1528（2015）01-0213-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.048

2014-05-04

中央高校基本科研业务费专项资金项目（ZYZ2012092）

董开忠（1971—），男（藏族），博士，副教授，主要从事天然产物应用和病原微生物研究。Te1：（0931）2938150，E-mai1：dkz@xbmu.edu.cn