张治云,刘荣磊,陈建英,邢玉仁,王勤,凌沛学△
(1.山东省药学科学院,山东省生物药物重点实验室 山东 济南 250101;2.山东福瑞达医药集团公司,山东省黏膜与皮肤给药技术重点实验室,山东 济南 250101)
透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接组成的一种链状聚阴离子黏多糖[1],是构成皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分,具有独特的理化性质和生物学功能[2]。HA是软骨基质组成成分之一,作为软骨细胞生长的基质,能促进软骨细胞代谢,并维持软骨细胞表型、促进软骨基质分泌[3],是构建复合软骨细胞支架的理想材料之一。天然的HA制备的支架材料具有良好的水溶性,但存在容易分散和被肌体组织中存在的酶及自由基降解,局部存留的时间较短的缺点,且缺乏维持支架材料所必须的力学性能[4];而通过引入交联剂使链状的HA交联形成网状结构所得到的材料,可以在一定程度上克服上述天然HA材料的缺陷,通过调节交联程度及制备工艺参数,可获得具有适宜降解速度和适宜孔隙大小的材料,有望成为一种较理想的组织工程细胞支架材料[5]。HA常用的交联剂有二乙烯基砜(divinyl sulfone, DVS)和 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE),比较而言,BDDE较DVS具有毒性小、反应性好等优点,正逐步取代 DVS 作为交联透明质酸(cross-linked hyaluronic acid,CHA)的主要交联剂[6]。由于BDDE化学性质活泼,其单体有致突变和致癌的潜在风险,因此,需要严格控制CHA支架材料中BDDE残留量。本研究建立了气相色谱法测定CHA细胞支架材料中BDDE残留量的方法,通过方法学研究证明方法专属性强、重现性好、灵敏度高,可用于CHA中BDDE残留量测定。
气相色谱仪(Agilent 7890A ,美国 Agilent);自动进样器(Agilent G4513A);氢火焰离子化检测器(FID) ;电子分析天平(Mettler XS205,瑞士 Mettler)。
无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,批号:20130514,色谱纯);BDDE(美国Sigma—Aldrich);CHA细胞支架材料(自制,批号:20130501、20130502、20130503)。
2.2.1色谱条件 安捷伦HP-5(30 m×0.32 mm,0.25 μm)毛细管柱;进样口温度为200℃,不分流模式进样;FID温度为250℃;载气为氮气,流速为2.0 ml·min-1;柱温采用程序升温,初始温度为90℃,以15℃·min-1升温至250℃,保持8 min;进样体积为1.0 μl。
2.2.2试样的制备 精密称取BDDE 16.65 mg,置事先加入适量无水乙醇的50 ml量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,摇匀,精密量取1.0 ml置50 ml量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,摇匀,作为贮备液,精密量取3.0 ml置25 ml量瓶中,加无水乙醇-水(6:4)稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。取CHA细胞支架材料80 mg,精密称定,剪碎,置10 ml量瓶中,加水4.0 ml静置过夜,加无水乙醇稀释至刻度,强力振摇10 min,用0.22 μm有机微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
2.2.3专属性试验 精密量取空白溶剂(无水乙醇-水=6:4)1.0 μl 注入气相色谱仪,记录色谱图;另精密量取BDDE 对照品溶液1 μl注入气相色谱仪,记录色谱图。
2.2.4线性关系试验 精密量取2.2.2项下BDDE对照品贮备液0.5、1、3、5、7 ml,分别置25 ml量瓶中,加溶剂(无水乙醇-水=6:4)稀释至刻度,摇匀,分别量取1 μl注入气相色谱仪,记录色谱图,以BDDE峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
2.2.5系统精密度试验 取2.2.2项下BDDE对照品溶液,按2.2.1条件连续测定6次,计算BDDE峰面积的精密度。
2.2.6对照品溶液稳定性试 BDDE对照品溶液配制后每隔一定时间,精密量取1 μl注入气相色谱仪,记录色谱图,考察BDDE峰面积随时间的变化趋势。
2.2.7定量限与检测限 取2.2.2项下BDDE对照品贮备溶液,逐级稀释成不同浓度的对照品溶液,依法测定,记录BDDE峰的信噪比。以S/N=10时为定量限,S/N=3时为检出限。
2.2.8重复性试验 取CHA细胞支架材料(批号:20130501)6份,每份80 mg,精密称定,依法测定样品中BDDE残留。
2.2.9回收率试验 取CHA细胞支架材料(批号:20130501)9份,每份80 mg,剪碎,置10 ml量瓶中,加水4.0 ml使充分溶胀;精密称取BDDE 13.32 mg,置事先加入适量无水乙醇的100 ml量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,摇匀,精密量取1.0 ml置50 ml量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。各取3份溶胀后的细胞支架材料,分别加上述对照品贮备液2.4、3.0和3.6 ml,加无水乙醇稀释至刻度,强力振摇10 min,用0.22 μm有机微孔滤膜过滤,取续滤液依法测定,计算BDDE回收率。
2.2.10样品测定 精密称取CHA细胞支架材料(批号:20130501、20130502、20130503),各约80 mg,置10 ml量瓶中,依法测定样品中BDDE残留。
空白溶剂进样,在BDDE出峰处无干扰峰,见图1。
图1 空白溶剂(A)及BDDE对照品溶液色谱图(B)
在0.133~1.865 μg·ml-1范围内BDDE的浓度与峰面积的线性关系良好,相关系数为0.9993。
对照品溶液连续测定6次,BDDE峰面积RSD为1.86 % (n=6),方法精密度良好。
72 h内BDDE峰面积无明显变化趋势,RSD为2.42 % (n=8),表明BDDE对照品溶液配制后至少在72 h内稳定。
BDDE定量限为0.104 μg·ml-1,检出限为0.036 μg·ml-1。
同一批次样品测定6次,均未检测到BDDE残留。
BDDE回收率见表1。
表1 BDDE回收率试验结果
CHA细胞支架材料(批号:20130501、20130502、20130503),均未检出BDDE。
细胞支架材料是组织工程领域的重要组成部分,理想的细胞支架材料应具有良好的生物相容性,适当的生物可降解性,易加工成形,并可在一定时间内保持外观和结构的完整性,具有一定机械强度能维持细胞形态和表型,并促进细胞粘附与增殖,诱导组织再生[7]。HA作为软骨细胞生长的基质,能促进软骨细胞代谢,是构建复合软骨细胞支架的理想材料之一,通过引入交联剂,使链状的HA交联形成网状结构,可延长材料在组织局部的存留的时间。
HA常用的交联剂有DVS和BDDE,由于交联剂化学性质活泼,单体有致突变和致癌的潜在风险,因此,需严格控制CHA中游离交联剂的残留量。朱彬等[8]、王悦等[9]采用气相色谱法测定DVS交联透明质酸钠凝胶中交联剂残留,样品处理采用乙醇萃取,使HA形成白色沉淀而DVS溶于乙醇中,直接进样测定。冯海等[6]采用荧光分光光度法和气相色谱法分别测定CHA凝胶中BDDE残留,两种方法定量限分别为0.53 μg·ml-1和1.85 μg·ml-1ml-1。自制CHA细胞支架材料为厚度1.5~2.0 mm的多孔状膜片,直接加乙醇,支架材料部分漂浮于乙醇中,不溶胀,不利于游离BDDE的提取。将支架材料剪碎后加适量水使其充分溶胀成凝胶,再加乙醇使CHA形成均匀絮状沉淀,可充分提取游离的BDDE,本试验通过色谱条件优化,采用不分流模式溶液直接进样,BDDE定量限为0.104 μg·ml-1ml-1,方法的检测灵敏度高于已报道的荧光分光光度法及气相色谱法。FDA批准的Restylane Silk Injectable Gel为采用BDDE交联的透明质酸钠凝胶,用于皮肤植入矫正口周皱纹,其浓度为20 mg·ml-1ml-1,产品中BDDE残留限值为2 μg·ml-1mg-1,折合成CHA中BDDE残留限值为0.1 μg·ml-1mg-1,参照该产品将CHA支架材料中BDDE残留限值暂定为0.1 μg·mg-1。