TGF-β对鼠牙源性间充质细胞生物学行为的影响

杨 薇

(中国中医科学院广安门医院南区口腔科，北京 102618)

1 引 言

生长因子作为诱导信号在上皮-间充质相互作用中有着重要作用，转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)是TGF-β细胞因子超家族的成员之一，参与调控牙胚发育、成牙本质细胞分化和胞外基质形成，在牙齿发育和牙髓损伤修复过程中发挥重要功能[1～2]。最新报道TGF-β与酸性成纤维细胞生长因子共同作用可促进牙乳头细胞极化和成牙本质细胞样细胞的功能分化以及前期牙本质的分泌[3]。本实验对出生后4 d大鼠牙源性间充质细胞离体培养并从时间效应上探讨TGF-β对其增殖和分化的影响，旨在探讨TGF-β对牙齿发育的调控作用模式。

2 材料与方法

2.1 动物、试剂、仪器

4～5 d SD大乳鼠,DMEM培养基,胎牛血清,胰蛋白酶,MTT,TGF-β,ALP检测试剂盒,Triton-100,CO2孵箱,体视显微镜,倒置显微镜,酶联免疫检测仪。

2.2 细胞培养

出生后4 d SD大鼠,分离上、下颌骨，取第一、二磨牙牙胚,DMEM液漂洗三遍,剪成糜状,置于含10%胎牛血清的DMEM的培养瓶中。置37℃、5%CO2孵箱中，2～3 d换液，细胞伸展覆盖培养瓶底80%～90%时,细胞贴壁法进行消化并传代。

2.3 细胞计数法检测细胞粘附情况

取生长良好的第四代牙源性间充质细胞，配成1.0×105/ml浓度接种于24孔板中，每孔1 ml，2～3 d换液1次，每隔24 h取3孔细胞，PBS冲洗，消化计数，每孔计三次，取平均值。以时间(d)为横坐标，细胞数(n×104)为纵坐标，绘制生长曲线图。

2.4 TGF-β对细胞增殖及 ALP 活性的影响

2.4.1接种细胞 将第四代牙源性间充质细胞，消化，离心，调整密度为1.0×104/ml，接种于96孔板，待细胞贴壁后，弃去原培养液，加入5 ng/ml的TGF-β培养液200 μl，设立无细胞的空白组和TGF-β浓度为零的对照组，2～3 d换液。

2.4.2MTT测定 1、3、5、7 d，每组取四孔，每孔加入5 mg/ml的MTT液20 μl，37℃孵育4 h，终止培养，吸弃孔内培养液，加入150 μl DMSO，微量振荡器震荡10 min，酶联免疫检测仪，波长490 nm，检测每孔光密度值(OD)。

2.4.3ALP活性测定 1、3、5、7 d，每组取四孔，吸弃培养液，PBS冲洗，加50 μl 0.1% Triton X-100，4℃过夜，加入100 μl ALP抗体，孵育30 min，加入0.2 mol/L氢氧化钠50 μl，酶联免疫检测仪410 nm波长测定OD值。

3 实验结果

3.1 细胞的培养观察

培养3～4 d后细胞从组织块边缘爬出，形成“生长晕”，最早出现多星形或梭形成纤维样细胞，散在，体积大，略扁平，传代后细胞生长旺盛，呈长梭形，胞体丰满，胞质均匀，少数细胞胞体可出现一个或多个突起。

图1 传代牙源性间充质细胞×100

图2 TGF-β诱导后的牙源性间充质细胞×400

3.2 诱导后细胞形态学变化

经TGF-β诱导5 d后，倒置显微镜下可见细胞生长状态良好，排列整齐，大量细胞具有细长的单极细胞浆突起，胞核位于突起的一侧，一些单极细胞出现平行排列状；对照组生长状态良好，但突起细胞较少(见图2)。

3.3 细胞生长曲线

在接种后1 d，细胞数有所下降，但到第2 d细胞总数开始增加，到第3～5 d进入指数增长期，第6 d以后，细胞增殖速度减慢，进入平台期，整个曲线呈“S”形，符合一般细胞生长规律。

3.4 TGF-β对牙源性间充质细胞的增殖的影响

随着培养时间的延长，OD值逐渐增高，培养第1、3、5、7 d均有统计学差异(P<0.05)，说明TGF-β对牙源性间充质细胞增殖起作用且随时间的延长而加强(见表1)。

表1 TGF-β对于牙源性间充质细胞增殖的影响

3.5 TGF-β对细胞ALP活性的影响

随着培养时间的延长，OD值逐渐增高，培养第1、3、5、7 d均与对照组比有统计学差异(P<0.05)，说明TGF-β能够增强牙源性间充质细胞的ALP活性且随培养时间的延长而加强(见表2)。

表2 TGF-β对于牙源性间充质细胞ALP活性的影响

4 讨论

牙齿是一种多胚层起源的器官，牙源性间充质细胞是牙本质和牙髓组织共同的起源细胞，其增殖和分化能力很强，其中牙釉质来源于牙胚发育早期的牙源性上皮细胞,而牙髓牙本质复合体起源于其周围的牙源性间充质细胞,两种细胞通过信号分子产生复杂的交互作用发育成牙齿,这种交互作用调控牙胚发育朝着精确而有序的方向进行[4-5]。TGF-β是 TGF-β细胞因子超家族的成员之一，通过调节细胞外基质、核内转录因子、细胞粘附分子等的表达，在牙胚发育、成牙本质细胞分化和第三期牙本质形成中发挥重要作用[6]。最新报道 TGF-β与酸性成纤维细胞生长因子共同作用可促进牙乳头细胞极化和成牙本质细胞样细胞的功能分化以及前期牙本质的分泌[3]。

本实验体外培养牙源性间充质细胞，因缺乏牙源性上皮中各种信号分子的诱导作用，所以在培养液中加入5 ng/mLTGF-β。镜下观察可见大量细胞发生形态学改变，出现单侧较长的细胞突起。MTT法发现1、3、5、7 d，TGF-β对于细胞增殖活力均与对照组相比有显著性差异，提示TGF-β能刺激体外培养的牙源性间充质细胞增殖。

ALP是重要的矿化组织相关蛋白，在硬组织形成中促进钙化的作用较为肯定，是牙乳头细胞分化和牙本质形成的重要标志之一。ALP活性增高被认为是成牙本质前体细胞分化、发生生物矿化的前提条件，与细胞分化状态密切相关。分化程度越高，分泌矿化基质的能力越强，则ALP活性越高。研究显示，成牙本质细胞和前体成牙本质细胞的ALP活性水平均比未分化的间充质细胞高[7-5]。在本实验中，1、3、5、7 d，TGF-β对ALP的影响持续增加，与对照组相比有统计学意义，说明随着作用时间的延长，发生分化的细胞数量增多、分化程度增高，提示TGF-β在鼠牙源性间充质细胞分化和矿化过程中可能起着重要的作用。综上所述， TGF-β可以诱导培养早期的牙源性间充质细胞的增殖与分化，并随时间延长，效应逐渐增强。