高效水解乳糖乳酸菌的筛选及发酵条件优化

刘曜综，曾小群*，潘道东王贤斌沈建良

（1.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211；2.河北科技师范学院动物科技学院，河北 秦皇岛 066000；3.浙江卓旺农业科技有限公司，浙江 湖州 313014）

高效水解乳糖乳酸菌的筛选及发酵条件优化

刘曜综1，2，曾小群1，*，潘道东1，王贤斌1，沈建良3

（1.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211；2.河北科技师范学院动物科技学院，河北 秦皇岛 066000；3.浙江卓旺农业科技有限公司，浙江 湖州 313014）

我国新疆地区传统酸马奶中乳酸菌资源丰富，为获得高效降解乳糖的乳酸菌及其发酵条件，本实验从分离自新疆酸马奶的14 株乳酸菌中，筛选出1 株高效水解乳糖的发酵乳杆菌RB-6，其乳糖水解率达37%。进一步利用单因素试验和正交 试验对发酵乳杆菌RB-6的发酵温度、接种量和发酵时间进行优化，获得其乳糖水解率最高的发酵条件为：发酵温度39 ℃、接种量3%、发酵时间8 h。发酵乳杆菌RB-6在该条件下发酵酸奶的乳糖水解率达47%，比优化前提高了10%。

筛选；乳糖水解；乳酸菌；发酵条件；优化

乳糖不耐症在我国成年人中十分普遍，影响了人们对牛奶中营养成分的吸收利用。由于成人体内缺乏β-半乳糖苷酶，牛奶中的乳糖不能在小肠中消化吸收，直接被运送到大肠发酵，使肠道内有机酸、CO2等大量积累，刺激肠黏膜，出现腹胀、腹痛、呕吐和腹泻等一系列的乳糖不耐受症状［1-2］。2012年我国牛奶产量超过3 000万 t，比十年前增加了 近10 倍，随着乳制品更多地进入人们的生活，乳糖的吸收利用问题也越来越受到关注［3］。

乳酸菌作为一种安全、应用广泛的重要益生菌，具有较强的乳糖水解能力，在无葡萄糖抑制条件下，乳酸菌可通过PTS转运系统（phosphotransferase systems）摄取磷酸乳糖，经磷酸β-半乳糖苷酶作用水解成6-磷酸半乳糖和葡萄糖，并分别经6-磷酸塔格糖途径和糖酵解途径分解；也可以在乳糖透性酶作用下直接摄取乳糖，进而由β-半乳糖苷酶作用水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖经发酵途径生成乳酸，起到缓解乳糖不耐症的作用［4-5］。研究表明，利用乳酸菌发酵酸奶可降解牛奶中30%～40%的乳糖［6］。同时，它还具有改善人体肠道、抑制腐败菌繁殖、降低胆固醇、降血脂、降血压、增强人体免疫力和抵抗力、抗肿瘤、预防癌症等功效［7］。

我国新疆地区许多家庭保持着自制酸马奶的传统，经过人类的长期驯化，酸马奶中的乳酸菌发酵水解乳糖的能力得到显著提高［8］。本实验对从新疆酸马奶中分离的14 株乳酸菌的水解乳糖能力进行比较，筛选出高效水解乳糖乳酸菌菌株，并进一步优化其发酵条件，提高乳酸菌发酵过程中的乳糖水解率。以在解决乳糖不耐症问题，提高牛奶中营养物质利用率，有效利用菌种优势，节约资源，治理环境污染等方面发挥作用。

1　材料与方法

1.1菌种与培养基

新疆酸马奶分离的1 4 株乳酸菌［9］：发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）RA-3、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RA-4、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RA-5、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RB-1、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）RB-2、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）RB-3、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）RB-4、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）RB-5、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）RB-6、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）RC-1、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）RC-2、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）RC-3、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）RC-4、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）RC-5，本实验室保存。

MRS固体培养基：乳酸菌专用MRS固体培养基杭州微生物试剂有限公司；牛奶液体培养基：高蛋白高钙脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司，配成139 g/L的脱脂奶；沉淀剂：120 g/L ZnSO4溶液、20 g/L NaOH溶液，体积比1：1取用；显色剂：10 g/L苯酚溶液、50 g/L NaOH溶液、10 g/L苦味酸溶液、10 g/L亚硫酸氢钠溶液，体积比1：2：2：1顺序混合。

1.2仪器与设备

UV-4802紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；恒温培养箱 宁波江南仪器厂；高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；高压立式蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；冰箱 青岛海尔股份有限公司；超净工作台 苏州华科净化设备有限公司；pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3高活性水解乳糖乳酸菌菌株的筛选

1.3.1乳糖标准曲线的绘制

精密称取分析纯的乳糖0.5 g，干燥2 h，溶解，移入500 mL容量瓶。分别吸取乳糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于25 mL比色管中并加入2.5 mL显色剂，加塞混匀，准确沸水浴6 min，稀释至25 mL，于520 nm波长处测定吸光度［10-11］。

1.3.2测定牛奶乳糖吸光度

取10 mL牛奶于200 mL容量瓶，再取25 mL稀释后牛奶于100 mL容量瓶，顺序加入5 mL ZnSO4溶液和5 mL NaOH溶液，沉淀溶液中的蛋白质，消除蛋白质对乳糖吸光度测定的影响。稀释至刻度，静置30 min，干燥滤纸过滤，弃去初滤液，收集滤液。同时制备对照组。分别取牛奶和对照组2 mL于25 mL比色管，加入2.5 mL显色剂，沸水浴6 min，稀释至25 mL，于520 nm波长处测定吸光度［10-11］。

1.3.3发酵液乳糖水解率测定

活化保藏菌种，3%接种量接种牛奶液体培养基，37 ℃恒温培养8 h。

发酵液3 000 r/min离心30 min，取上清液，按1.3.2节所述的方法处理发酵液、测定吸光度。并按如下公式对乳糖质量浓度和乳糖水解率进行计算。

式中：R为乳糖水解率/%；ρ1为牛奶乳糖质量浓度/（mg/mL）；ρ0为发酵液乳糖质量浓度/（mg/mL）。

1.4乳酸菌水解乳糖发酵条件的优化

1.4.1单因素试验

将筛选获得乳酸菌种以3%接种量接种于牛奶液体培养基，分别在35、36、37、38、39 ℃条件恒温培养8 h，每一温度设置3 次重复，确定最佳发酵温度。分别以1%、2%、3%、4%、5%接种量接种于牛奶液体培养基，37 ℃恒温培养8 h，每一接种量设置3 次重复，确定最佳接种量。以3%接种量接种乳酸菌于牛奶液体培养基，分别于37 ℃恒温培养6、7、8、9、10 h，每一发酵时间设置3 次重复，确定最佳发酵时间。

1.4.2正交试验

在单因素试验结果基础上，以发酵温度、接种量、发酵时间为主要影响因素，乳糖水解率为响应值，做三因素三水平正交试验，每一处理设置3 次重复，确定最佳发酵条件。正交试验获得最佳发酵条件后，进一步做验证实验，测定在该条件下的乳糖水解率。

2　结果与分析

2.1乳糖标准曲线

以乳糖吸光度为横坐标（X）、乳糖质量浓度为纵坐标（Y），绘制乳糖标准曲线。结果显示在0～2.5 mg/mL范围内，乳糖质量浓度和乳糖吸光度呈良好的线性关系：Y=3.567X+0.033（R☒=0.985 5）。以2.5 mg/mL乳糖溶液测定乳糖吸光度，相对标准偏差为0.2%（n=5），说明精密度良好。

2.2不同菌种乳糖水解率比较

图1　不同乳酸菌菌株乳糖水解率比较Fig.1 Comparisons of lactose hydrolysis rates among different lactic acid bacteria

14 株乳酸菌的乳糖水解率见图1，其中发酵乳杆菌RB-6乳糖水解率最高，达37%；其次为发酵乳杆菌RC-3，乳糖水解率为34%；发酵乳杆菌RB-2的乳糖水解率最低，仅为14%。在这14 株乳酸菌中，发酵乳杆菌RB-6、发酵乳杆菌RC-3、植物乳杆菌RA-4的乳糖水解率较高，均高于30%；发酵乳杆菌RB-2、发酵乳杆菌RB-3、戊糖乳杆菌RC-4的乳糖水解率较低，均低于20%；有11 株乳酸菌的乳糖水解率高于20%；说明新疆酸马奶为筛选降解乳糖乳酸菌的较好来源。

2.3单因素试验结果

图2　发酵温度（A）、接种量（B）、发酵时间（C）对发酵乳杆菌RB-6乳糖水解率的影响Fig.2 Effects of fermentation temperature （A）， inoculum size （B） and fermentation period （C） on rates of lactose hydrolysis by Lactobacillus fermentum RB-6

由图2A可知，发酵乳杆菌RB-6在39 ℃时，乳糖水解率最高；发酵温度在35～39 ℃范围内，乳糖水解率由18%增加到了47%，随温度上升而增加。当接种量为3%时，乳糖水解率最高，达37%；接种量为1%～3%，乳糖水解率呈上升趋势，由23%上升到37%；但接种量为3%～5%，乳糖水解率从37%下降到25%（图2B）。由图2C可知，发酵6～10 h内，乳糖水解率逐渐上升，在发酵10 h时乳糖水解率最高，达41%。

2.4正交试验结果

表1　正交试验方案设计及结果Table1 Orthogonal array design with experimental results

正交试验结果（表1）表明，乳糖水解率最高的发酵条件为A3B2C3，即发酵温度39 ℃、接种量3%、发酵时间8 h。方差分析结果（表2）表明，发酵温度对发酵乳杆菌RB-6发酵乳糖水解率的影响极显著，接种量和发酵时间对乳糖水解率的影响显著，其影响主次排序为：发酵温度＞接种量＞发酵时间。

表2　方差分析Table2 Analysis of variance

2.5验证实验

在正交试验所得的乳糖水解率最高的条件下发酵，即发酵温度39 ℃、菌种接种量3%、发酵时间8 h，测得在该条件下发酵得到的乳糖水解率为47%，高于正交试验各组的乳糖水解率，与理论预测值相符。表明通过正交试验得到的发酵条件结果是可靠的。

3　讨 论

新疆酸马奶中分离的不同优良乳酸菌具有不同乳糖水解能力、产酸能力和发酵性能［8-9］。本实验通过正交试验筛选出的发酵乳杆菌RB-6，以3%接种量，39 ℃培养8 h，乳糖水解率为37%。优化发酵条件后，其乳糖水解率达到47%，比优化前提高了10%，据文献报道，牛奶的乳糖水解率达50%左右就可以很好的克服乳糖不耐症的问题［12］。本实验所得到的酸奶的乳糖水解率高于文献［13］所述黑曲霉的30.8%，虽然低于武波波等［14］报道的低乳糖酸奶中的乳糖水解率63%，但该低乳糖酸奶中添加了外源乳糖酶，而本实验所得到的酸奶为发酵乳杆菌RB-6发酵过程中产生的，更安全自然，并可以有效起到预防乳糖不耐症的作用。

单因素试验结果显示，发酵乳杆菌RB-6在39 ℃条件乳糖降解率最高，表明在39 ℃时乳酸菌产β-半乳糖苷酶活性最强，适宜乳酸菌发酵乳糖。熊素玉等［15］研究不同温度对分离自新疆酸马奶乳酸菌生长的影响，发现多数乳酸菌的最适生长温度在40 ℃左右，这与本实验获得结果基本一致。但同陆文伟等［16］在pH 5.5，20%乳糖条件对发酵乳杆菌β-半乳糖苷酶转糖基活性的研究存在差异，可见在不同的乳糖质量浓度、pH值条件下，乳糖最适发酵温度也不相同。在发酵6～10 h时间段内，随时间延长，β-半乳糖糖苷酶活性增强，也就使乳糖降解率随时间增加而相应增加［17］。

在食品工业中，乳酸菌是发酵生产酸奶的重要菌种，水解乳糖成本低廉，发酵条件温和，易于控制，杂质混入的可能性较小［18-20］。另外，乳酸菌作为一种益生菌，安全可靠的同时，还可发挥益生作用，缓解乳糖不耐症，增强免疫力促进人体尤其是肠道的健康，降低高血压、肿瘤、脂肪肝等疾病的患病风险［19-22］。本实验筛选的高效水解乳糖乳酸菌，为降解乳糖提供了一种经济、有效、无污染的生物途径，采用水解乳糖能力较高的菌种生产的酸奶中乳糖含量更低，同时，为乳糖发酵提供了可选的优化条件，有利于乳酸菌利用碳水化合物产生乳酸，增加酸奶的酸度，减少凝乳时间，在生产发酵乳制品、调味品、功能性食品等领域都有着广阔的前景［19-25］。同时，随着发酵工业对优势菌种需求的不断提升，高效水解乳糖乳酸菌也为采用定向诱变、DNA重组、原生质体融合技术等方法获得高产超级工程菌丰富了菌种资源，具有广泛的经济和研究价值。

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Screening of Lactic Acid Bacteria with High Lactose-Hydrolyzing Ability and Optimization of Fermentation Conditions

LIU Yaozong1，2， ZENG Xiaoqun1，*， PAN Daodong1， WANG Xianbin1， SHEN Jianliang3
（1. School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo 315211， China；2. Animal Science Department， Hebei Norma l University of Science and Technology， Qinhuangdao 066000， China；3. Zhejiang Zhuowang Agricultural Science and Technology Co. Ltd.， Huzhou 313014， China）

Koumiss， a traditional fermented mare’s milk in Xinjiang province of China， is an abundant source of lactic acid bacteria. Fourteen strains of lactic acid bacteria from Koumiss were screened for lactose-hydrolyzing ability. A strain of Lactobacillus fermentum RB-6 with high rate of lactose hydrolysis （37%） was obtained. Single-factor and orthogonal array designs were used to optimize the inoculum quantity， fermentation temperature， and fermentation time for the selected strain. The results indicat ed that when the fermentation was carried out for 8 h with an inoculum size of 3% at 39 ℃， the rate of lactose hydrolysis was 47%， which was increased by 10% as compared with that before optimization.

screening； lactose hydrolysis； lactic acid bacteria； fermentation conditions； optimization

TS252.42

A

1002-6630（2015）03-0090-04

10.7506/spkx1002-6630-201503017

2014-03-10

国家自然科学基金青年科学基金项目（41406165）；国家星火计划项目（2014GA701048；2013GA701018）；浙江省科学技术厅重大科技专项计划项目（2012C12016-1）

刘曜综（1989—），男，硕士研究生，研究方向为农畜产品加工。E-mail：1137910323@qq.com

曾小群（1982—），女，讲师，博士，研究方向为畜产品加工。E-mail：zxqun3447@126.com