柱前衍生液相色谱-串联质谱法测定珍珠粉中氨基酸

郭 华， 朱智甲*,2， 周晓雅， 吴 文

(1.东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620；2.东华大学生态纺织品教育部重点实验室，上海 201620)

氨基酸结构简单且类似，但大多数氨基酸分子没有荧光和生色基团，难以直接区分和检测，因此柱前或柱后衍生化是提高和改善氨基酸检测灵敏度的有效途径。常用的衍生化试剂有：邻苯二甲醛(OPA)、9-芴基甲氧基羰酰氯、异硫氰酸苯酯和丹酰氯等。其中，OPA与氨基酸衍生化反应步骤简单、反应迅速(<30 s)、衍生物可用多种检测器检测,因而被广泛应用[1,2]。

目前,报道的氨基酸分析方法主要有：毛细管电泳法[3，4]、离子交换色谱法[5，6]、柱前衍生-气相色谱法[7，8]、气-质联用法[9]和液相色谱法[10，11]。这些方法灵敏度和重现性不够理想，而且基体干扰大，而液-质联用法报道较少[12]。本文以OPA为柱前衍生化试剂、利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测，建立了分析氨基酸的新方法，并用于珍珠粉中氨基酸检测，有效克服了样品基体的影响。该方法样品前处理简单、选择性好、灵敏度高、分析速度快、具有较好的应用价值。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Varian 310三重四极杆液相色谱质谱联用仪(美国，瓦里安公司)，配有Varian Prostar210高效液相色谱仪、Varian 410自动进样器、Varian workstation数据处理软件与电喷雾离子源(ESI)。

氨基酸标准品：精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、天冬氨酸(Asp)和亮氨酸(Leu)均为Sigma产品。氨基酸混合标准储备液(100 μg/mL)：准确称取一定量氨基酸标准品，用pH=10.5缓冲溶液配成25 mL混合标准储备液。各级氨基酸混合标准工作溶液由储备液用缓冲溶液逐级稀释即可。衍生试剂的配制：准确称取0.0200 g OPA于10 mL容量瓶中,用1 mL甲醇溶解,加入20 μL巯基丙酸，用甲醇定容，震荡均匀后，储藏于4 ℃冰箱中待用。pH=10.5的硼酸-NaOH缓冲溶液。实验用水为去离子重蒸水。

1.2 色谱与质谱条件

1.2.1色谱条件色谱柱：Welch Topsil C18柱(150×2.1 mm,3 μm)；流动相：10 mmol/L HAc-NH4Ac溶液(A)∶乙腈(B);流速:0.3 mL/min;线性梯度：0～2 min,5%B;4～20 min,70%B;21～30 min,5%B;柱温：35 ℃;进样量：20 μL。

1.2.2质谱条件电喷雾离子源,正离子扫描,多反应监测模式(MRM)；喷雾针电压：5 500 V；筛板电压：600 V；雾化气温度及压力：250 ℃、50 psi；干燥气温度及压力：300 ℃、22 psi；检测电压：1 200 V。

1.3 样品前处理

称取珍珠粉约10 g于500 mL烧杯中，加入10 mL水调成糊状。搅拌下缓慢分次加入6 mol/L HCl酸化4次(每次10 mL)，放置待泡消退后抽滤，以水洗涤至洗液呈中性，得黄色粗蛋白，备用。称取粗蛋白约10 mg 于15 mL 耐温耐压瓶中，准确加入5 mL 6 mol/L HCl，加盖密封，于温度110 ℃下水解24 h。取出放冷，将水解液移至蒸发皿中，水浴蒸至近干，残渣以水溶解，移入10 mL容量瓶中，用水定容，摇匀，微孔滤膜过滤即可[13]。

1.4 衍生及分析

准确移取100 μL标准溶液或样品溶液于1 mL小试管中,加入50 μL衍生化试剂,充分混匀，避光反应2 min，用0.22 μm滤膜过滤，取20 μL 注入液-质联用仪分析,以碎片离子荷质比定性,二级质谱峰面积外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 衍生化条件的优化

2.1.1缓冲溶液pH值和衍生化时间的选择在pH=7.5～11范围内，考察了pH值对衍生反应的影响，随着pH值升高，衍生产物稳定性增强，考虑到色谱柱耐受性，选择10.5作为最佳pH值。另外，衍生反应时间2 min后，衍生反应已经充分完成，因此本文选择2 min作为衍生化反应时间。

2.1.2OPA用量对衍生反应的影响考察了OPA与氨基酸摩尔比分别为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、50∶1时的反应情况。结果表明，当摩尔比≥10∶1时，衍生化反应进行完全，故选择OPA与氨基酸的摩尔比为10∶1。

2.2 色谱分离条件的优化

图1 7种氨基酸衍生物的色谱图Fig.1 The chromatogram of 7 amino acid derivatives

分别采用甲醇-水、乙腈-水做流动相，但甲醇体系柱压高，且在正离子模式下加入HAc可以提高质谱响应，为了稳定流动相的pH,选用10 mmol/L HAc-NH4Ac体系。同时考察了流动相0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min流速对分离的影响，柱压随着流速的增加而升高且分离度降低，本文选择0.3 mL/min为最佳流速。为了实现氨基酸衍生物分离，本文采用梯度洗脱方式。总离子流图见图1。

2.3 质谱条件的优化

正离子模式下信号较强，因此采用正离子模式监测。在全扫描模式下，获得了氨基酸衍生物的母离子，在选择离子扫描模式下优化了裂解电压；在子离子监测模式下优化了碰撞能量；依据在子离子扫描模式下，一般选择除母离子之外丰度高且稳定的离子为定量子离子原则，确定了相应的定性和定量离子对。离子对、具体的毛细管电压、碰撞能量如表1所示。

表1 氨基酸衍生物的MRM扫描参数

(续表1)

Amino acidDeeivativePrecursor ion(m/z)Product ion(m/z)Capillary(V)CE(V)352274∗175502030310205∗117502030379335∗229401015294189∗144602030336175∗130402530370265∗2206020

*quatitative ion.

2.4 线性方程、相关系数及检出限

准确移取氨基酸混合标准工作溶液，配制混合标准系列溶液，按照优化实验方法衍生化并进行分析，以氨基酸浓度(c)为横坐标，二级质谱峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。本文获得的线性范围、回归方程、相关系数、以及以三倍信噪比计算的检出限(LOD)数据详见表2。

表2 氨基酸测定的线性范围，回归方程，精密度、检出限与加标回收率

2.5 精密度和加标回收率

对1.0 μg/mL氨基酸混合标准溶液，重复进样7次，计算峰面积相对标准偏差(RSD)，结果列于表2。对珍珠粉样品溶液，添加0.50 μg/mL的氨基酸混合标准溶液，测定加标回收率，结果见表2。

2.6 样品分析

对某药店购买的珍珠粉样品，按照前处理方法制备样品溶液，衍生化后进行液-质联用分析，测得该品牌珍珠粉中7种氨基酸的含量依次为：Ala,0.057%；Asp，0.013%；Arg，0.001%；Glu，0.018%；Leu，0.11%；Phe，0.041%和Ser，0.034%。

3 结论

本文对珍珠粉进行酸化水解，以邻苯二甲醛为柱前衍生化试剂，采用LC-MS/MS联用技术，建立了珍珠粉中氨基酸测定的新方法。该方法前处理简单，选择性好，灵敏度高，适用于珍珠粉样品中氨基酸的测定。