SD大鼠超数排卵的优化

张婀娜， 郎雪楠， 赵　文， 陈雪婷， 董婉维， 周生来， 于　洋， 王　惟， 张梅英， 郑志红

（中国医科大学实验动物部　辽宁省转基因研究重点实验室， 沈阳　110001）

·经验交流·

SD大鼠超数排卵的优化

张婀娜， 郎雪楠， 赵文， 陈雪婷， 董婉维， 周生来， 于洋， 王惟， 张梅英， 郑志红

（中国医科大学实验动物部辽宁省转基因研究重点实验室， 沈阳110001）

目的通过对鼠龄及激素剂量的控制研究其对SD 大鼠排卵的影响。方法分别采用三种不同剂量PMSG/hCG组合（PMSG/hCG:20 IU/20 IU、25 IU/25 IU、30 IU/30 IU）对4、5、6周龄的SD 大鼠进行超数排卵处理，以超数排卵总卵数、正常受精卵数、异型卵数作为评判标准，确定最佳超排剂量及鼠龄。结果20 IU剂量时，三种周龄大鼠分别获取胚胎 24.72枚、33.12枚、15.22枚，其中正常受精卵:21.58枚、29.1枚、13.1枚，异型卵: 2.01枚、1.01枚、2.12枚； 25 IU剂量时，三种周龄大鼠分别获取胚胎37.63枚、43.62枚、20.78枚，其中正常受精卵22.67枚、38.6枚、18.5枚，异型卵: 2.82枚、1.23枚、2.28枚； 30 IU剂量时，三种周龄大鼠分别获取胚胎51.69枚、61.36枚、30.2枚，其中正常受精卵47.2枚、60.8枚、25.6枚， 异型卵: 1.23枚、0.56枚、1.3枚。结论5周龄，激素剂量30 IU为大鼠超排的最适周龄及最佳激素剂量，为基因工程动物制备及胚胎冷冻实验提供技术保障。

超数排卵； 激素； 周龄； SD大鼠

从基因工程小鼠出现至今，其对于基因功能的阐释及人类疾病发病机制的研究发挥了巨大的作用。但是随着Talens、CRISPR/CAS9 技术的突破与完善，大鼠因其自身的生理学特性，其应用也越来越广泛。SD 大鼠是国际上通用的大鼠品系，遗传背景明确，具有独特的生理学特性，在转基因及基因敲除动物制备中广为使用。

与小鼠相比，大鼠的遗传操作起步较晚且仍需完善，大鼠排卵仍存在个体差异明显、受精率低、胞质抗损伤能力差等诸多问题。超数排卵获得大量优质胚胎是制备转基因及基因敲除动物的前提和基础［1］，关于SD大鼠超数排卵程序尚不完善，胚胎回收率与可用胚胎数仍不够稳定，分析原因主要与大鼠周龄和超数排卵剂量有关。本研究通过对不同周龄SD大鼠给予不同剂量的激素研究这些因素对大鼠超数排卵的影响，以获得最佳的超数排卵条件， 为制备基因工程动物模型奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料

实验动物: 4、5、6周龄清洁级雌性SD大鼠各30只，雄性SD大鼠90只，均购自北京维通利华实验动物有限公司［SCXK（京）2012-0001］， 分别单笼饲养在清洁级动物房，温度23±2℃， 自动光控（光照时间7∶00-19∶00）［SYXK（辽）2013-0007］。

矿物油（胚胎级）、M2培养液、透明质酸酶均为Sigma公司产品，孕马血清促性腺激素（PMSG）为宁波市三生药业有限公司产品，人绒毛膜促性腺激素（hCG）为丽珠集团丽珠制药厂产品。体视显微镜（OLympus）、CO2培养箱（Galaxy S）等。

1.2大鼠分组

将所选的4、5、6周龄雌鼠按周龄随机分为9组，每组10只。

1.3超数排卵

1～3组、4～6组、7～9组分别于下午15∶00注射PMSG 20 IU、25 IU、30 IU，48 h后注射相同剂量的hCG， 注射hCG后雌鼠与同品系雄鼠按照1∶1的比例合笼。次日清晨检出带有阴栓的雌性大鼠。

1.4培养基准备

采卵的前1 d下午16∶00，用mR1ECM培养液制作培养碟，石蜡油覆盖，放入37.0℃、5% CO2培养箱过夜培养。

1.5采卵碟的准备

采卵当日早上8∶00，用小型培养皿做采卵碟（M2培养液覆盖石蜡油），放入37.0 ℃、体积分数5% CO2培养箱培养备用。

1.6取卵

采用颈椎脱位法处死见栓的大鼠，收集输卵管，用自制灌流针在实体解剖镜下将受精卵从输卵管伞部轻轻吹出，清洗3～5次后移入胚胎培养液并记数卵的数量，将其置于37.0 ℃ 体积分数5% CO2培养箱中。在镜下分别统计总卵数、正常受精卵数（判断标准为: 排出第二极体并有两个原核胞质均匀无异常卵裂）和异型卵数量（判断标准: 胚胎无可见原核，注射前异常卵裂，胚胎体积明显小于正常胚胎）。

1.7统计分析

采用SPSS 11.0软件进行统计分析，组间比较用方差分析，数据以均数±标准差（x-±s）的形式表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

总卵数及正常受精卵数5周龄多于4周龄和6周龄（P＜0.05），异型卵数5周龄少于4周龄和6周龄（P＜0.05）； PMSG/hCG组合30 IU/30 IU 剂量时所获得的总卵数和正常受精卵数均比20 IU/20 IU和25 IU/25 IU多（P＜0.05），异型卵数比20 IU/20 IU 和25 IU/25 IU少（P＜0.05）（表1）。

表1　不同周龄SD大鼠超排卵数

3　讨论

原核显微注射是制备基因工程动物最常用的技术手段之一，而原核显微注射的效率并不高，只有5%～30%，因此获得足够数量的优质胚胎是制备基因工程动物的必要条件之一。建立稳定有效的大鼠超数排卵方案，对于最终获得基因工程大鼠尤为重要［2］。

哺乳动物雌体一生产生的卵子总数是在其胚胎发育形成卵巢的过程中确定的，成熟的卵子在哺乳动物成年后的发情周期中分别排出。为了获得最大数量的卵母细胞，通常采用超数排卵的方法，用外源激素处理雌性动物，改变其性周期，使之按照预定时间超常量的排卵，以此降低成本，提高繁殖效率［3］。然而，实验动物的品系、品种、动物年龄与生殖健康状态、激素使用剂量、PMSG 和hCG 注射时间及其间隔时间等多种因素均会影响超数排卵效果［4］。有文献报道［5］，激素用量并不与超数排卵数量呈正相关， 激素剂量过低， 外源激素不能满足较多卵母细胞发育的需要，对动物起不到超数排卵的作用； 激素剂量过高，影响了卵子的运行速度而导致卵母细胞排放率下降，反而抑制排卵部分卵子残留在卵泡中不能排出导致卵巢囊肿。

本实验以前人研究［6］为基础，结合本单位自身技术优势［7］，在保证动物质量、环境因素相同的情况下对其激素剂量和动物周龄进行实验，比较其排卵数、正常受精卵数以及异型卵数，从而探索最佳的超数排卵条件。通过表1可见: 6周龄大鼠排卵均比4、5周龄少，所以6周龄大鼠不适合超数排卵； 30 IU剂量组得到的总卵数和正常受精卵最多，所以此剂量组为最适合的超数排卵剂量； 5周龄时异型卵数最少，所以5周龄为最合适的超数排卵周龄。超数排卵是极其复杂的生理过程， 其影响因素很多， 本文仅针对不同剂量、不同周龄进行了初步探讨研究， 得出以下结论: 30 IU的PMSG+hCG组合超数排卵效果优于20 IU和25 IU； 5周龄大鼠超数排卵效果优于4和6周龄大鼠。因此，判定SD大鼠的超数排卵以PMSG/hCG 30IU剂量组合、5周龄效果最好。

［1］卞洲艳， 杨政， 徐蔓， 等. SD大鼠超排及TALEN质粒显微注射构建基因敲除大鼠［J］. 海南医学， 2013， 24（21）:3121 3125.

［2］ 卫晓弈， 章蓉， 金宇娟， 等. 转基因SD大鼠构建技术的研究［J］. 扬州大学学报， 2009， 30（1）:26-30.

［3］宋远征， 王怡， 王宝珠， 等. 激素剂量、小鼠品系及周龄对超数排卵的影响［J］. 实验动物科学， 2011， 28（4）:6-8.

［4］戴丽军， 黄月玲， 叶炳飞 C57BL/6J小鼠超排卵的研究［J］中国实验动物学报， 2003， 11（1）:51-53.

［5］邱泽文， 姜午旗， 高丽波， 等. 不同激素剂量和组合对不同品系小鼠超数排卵的影响［J］. 中国组织工程研究与临床康复， 2011， 15（53）:9977-9980.

［6］周生来， 于洋， 王维， 等. SD大鼠超排卵及胚胎冷冻方法比较［J］. 中国比较医学杂志， 2008， 28（6）:398-400.

［7］郑志红， 杨蒇， 周生来， 等. 激肽释放酶转基因大鼠模型的建立［J］. 中国比较医学杂志， 2007， 17（8）:463-466.

Q95-33

B

1674-5817（2015）04-0316-02

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.012

2015-05-31

辽宁省科技计划项目（2013408001）

张婀娜（1988-）， 女， 本科， 助理实验师。E-mail: 731219482@qq.com

郑志红， 教授。E-mail: zhihongzheng@163.com