氟西汀预处理对SD大鼠脑缺血再灌注损伤的脑保护作用

聂 琛，高 政，孙文芳，郑瑞红

(大连医科大学附属第二医院 神经内科，辽宁 大连 116031)

论 著

氟西汀预处理对SD大鼠脑缺血再灌注损伤的脑保护作用

聂 琛，高 政，孙文芳，郑瑞红

(大连医科大学附属第二医院 神经内科，辽宁 大连 116031)

目的 探讨预防性应用氟西汀对SD大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的脑保护作用。方法 48只健康雄性SD大鼠随机分为脑缺血再灌注组(对照组，n=24)和氟西汀组(n=24)，对照组与氟西汀组均制备大鼠右侧大脑中动脉闭塞的脑缺血再灌注模型，分别于术前14d胃内灌注生理盐水和氟西汀。各组按缺血2 h再灌注2 h、6 h、24h再分为3个亚组(n=8)。比较相同再灌注时间点两组的神经功能缺损评分、脑梗死体积及缺血侧海马区半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达情况。结果 相同再灌注时间点，氟西汀组较对照组神经功能缺损评分值降低，其中再灌注2 h及6 h，两组间比较差异均无显著性意义(P>0.05)，再灌注24h，两组间比较差异具有显著性意义(P<0.05)；氟西汀组较对照组脑梗死体积减小，其中再灌注2 h及6 h，两组间比较差异均无显著性意义(P>0.05)，再灌注24h，两组间比较差异具有显著性意义(P<0.01)；氟西汀组缺血侧海马区Caspase-3阳性表达细胞数在相同再灌注时间较对照组均减少，差异具有显著性意义(P<0.05)。结论 氟西汀具有神经保护作用，预防性应用氟西汀在脑缺血再灌注损伤急性期即起显著作用，其机制可能与其减少Caspase-3的表达有关。

氟西汀；脑缺血再灌注；Caspase-3

随着人口的老龄化，缺血性脑血管病已成为威胁中老年人健康和生存质量的常见病和多发病，脑缺血引起的脑组织损伤不仅见于严重缺血本身，也见于血流再通后。虽然一方面恢复局部的血流供应，清除有毒的代谢产物，有利于局部组织的存活和修复，但另一方面它同时通过细胞因子、细胞凋亡、氧自由基、细胞内钙超载等机制进一步加重局部组织损伤，即所谓再灌注损伤。

氟西汀(Fluoxetine，Prozac)是选择性五羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRI)的代表性药物，第一个应用于临床治疗抑郁症，后来也用来治疗脑卒中后抑郁，其抗抑郁疗效是明确和肯定的。近年来有临床实验研究证明氟西汀具有神经保护作用[1]，这种保护作用可能与其上调脑源性神经营养因子有关。但目前关于预防性应用氟西汀对脑缺血再灌注损伤的保护作用的研究少有报道。本研究旨在通过预防性应用氟西汀，观察SD大鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损评分、脑梗死体积和缺血侧海马区半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达情况，从动物实验角度探讨预防性应用氟西汀能否减轻脑缺血再灌注损伤，是否具有神经保护作用及其可能的机制，从而为缺血性脑血管病的临床治疗及以氟西汀为代表的SSRI类药物在临床中更广泛应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，体重180～220 g，由大连医科大学动物实验中心提供，分笼温室饲养，自由进食饮水，自然昼夜，术前禁食12 h。

1.2 主要药品和试剂

氟西汀胶囊(美国礼莱公司，20 mg/粒，Prozac)；兔抗大鼠Caspase-3抗体(美国NEOMARK公司)；氯化三苯四唑啉(TTC)(中国医药集团上海化学试剂公司)；SP试剂盒、DAB显色剂(美国SANTAZ公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组：48只健康雄性SD大鼠，随机分为两组：脑缺血再灌注组(对照组，n=24)、氟西汀组(n=24)，各组按缺血2 h,再灌注2 h(n=8)、6 h(n=8)、24h(n=8)分为3个亚组。

1.3.2 大鼠大脑中动脉闭塞的缺血再灌注模型制备：参照改良的 Longa-Zea 氏线栓法[2]制作大鼠大脑中动脉(MCA)闭塞的脑缺血再灌注模型，所有大鼠均栓塞右侧MCA。模型成功的标志是动物苏醒后出现同侧的Horner征(眼裂变小，眼球内陷)和对侧以前肢为重的偏瘫。于栓塞2 h不再麻醉拔出栓线，分别于再灌注后2 h、6 h、24h(每个亚组8只)处死动物。

1.3.3 给药方法：用生理盐水将氟西汀胶囊内粉末溶解，配制成20 mg/100 mL混悬液。氟西汀组大鼠术前14d予氟西汀(2.0 mg/kg·d)行灌胃治疗，1次/d；对照组均于术前14d胃内灌注等容积生理盐水，1次/d。

1. 4 观察指标

1.4.1 神经功能缺损评分：参照Zea-Longa 5分制评分标准分别于再灌注后2 h、6 h、24h进行神经功能评分：0分：无神经功能缺损症状；1分：不能伸展对侧前爪；2分：行走时向偏瘫侧转圈；3分：向偏瘫侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

1.4.2 脑梗死体积的测定：于不同再灌注时间点过量水合氯醛腹腔注射麻醉处死大鼠，迅速断头取脑速冻15min，经视交叉水平行冠状切片(脑片厚度约1.5mm，共A、B、C、D、E 5个脑片)，C片常规做石蜡包埋，用做免疫组化和HE染色，其余脑片置于2% TTC磷酸盐缓冲液中避光，37 ℃恒温温育30 min，10%福尔马林后固定，正常脑组织着深红色，梗死脑组织不着色。各脑片在同等条件下用数码相机正反面拍照，采用病理图像分析仪系统测定每片梗死面积及该片总面积，按公式：[ (各片正反面梗死面积之和/ 2) ×片厚]/ [ (各片正反面总面积之和/ 2) ×片厚]] ×100 %计算出梗死体积/大脑体积百分比，以此作统计分析。其中第C片脑片正反面面积以B及D片相邻面表示。

1.4.3 用SP免疫组织化学法测定Caspase-3的表达：显微镜下观察并计数阳性细胞，镜下胞浆有棕黄色颗粒者为阳性细胞，阴性结果则无棕黄色颗粒。每张切片在40×10倍光镜下随机选取海马区内4个不重叠的视野，分别计数Caspase-3免疫反应阳性细胞数量，取均值作为各时间点阳性表达细胞数。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 神经功能缺损评分

相同再灌注时间点，氟西汀组较对照组神经功能缺损评分降低，其中再灌注2 h及6 h，两组间比较差异无显著性意义(P>0.05)，再灌注24h，两组间比较差异有显著性意义(P<0.05)。见表1。

2.2 脑梗死体积测定

相同再灌注时间点，氟西汀组较对照组脑梗死体积减小，其中再灌注2 h及6 h，两组间比较差异无显著性意义(P>0.05)，再灌注24h时两组间比较差异有显著性意义(P<0.01)。见表2、图1。

表1 神经功能缺损评分在两组各再灌注时间点的比较

表2 梗死体积/总体积百分比在两组各再灌注时间点的比较

图1 再灌注24h两组间脑梗死体积的比较

2.3 免疫组化结果

氟西汀组较对照组Caspase-3阳性表达细胞数减少，其中再灌注2 h、6 h时两组间比较均为P<0.05，再灌注24h时两组间比较P<0.01。见表3、图2。

表3 Caspase-3表达在两组各再灌注时间点的比较

3 讨 论

氟西汀作为SSRI的代表性药物，第一个应用于临床治疗抑郁症，后来也用于治疗脑卒中后抑郁，其抗抑郁机制为：氟西汀能选择性作用于5-羟色胺(5-HT)输送体，抑制5-HT的再摄取，增高突触间隙中的5-HT浓度。

目前国内外对氟西汀的研究大多集中于其改善抑郁症状及卒中后抑郁，并发现其能促进卒中后抑郁患者的神经功能康复。Dam等[3]发现氟西汀的与其促进神经功能康复无关。周波等[4]利用氟西汀对脑卒中后非抑郁患者进行干预性治疗，发现氟西汀可以明显改善脑卒中后非抑郁患者的神经功能和日常生活能力。王占军等[5]研究发现长期预防性应用氟西汀可以通过增加梗死灶周围和缺血损伤侧海马区BDNF的表达对大鼠脑缺血再灌注损伤起到保护作用。上述研究均提示：氟西汀在一定程度上对单纯脑卒中患者的中枢神经系统损伤具有修复作用[6]，但作用机制不明。

氟西汀的神经保护作用可能与以下机制有关：(1)长期应用氟西汀可以促进5-HT递质的功能。5-HT可以促进突触的形成，增强5-HT能突触的传递作用，提高脊髓运动神经元的功能，从而通过改善神经运动功能促进脑损伤后的功能恢复[7]。(2)长期应用氟西汀可以上调5-HT2受体改善运动功能[8]。(3)长期应用氟西汀还可以上调肾上腺素受体从而间接加快运动功能的恢复[9]。(4)氟西汀能促进海马区神经干细胞的增殖[10]，增加齿状回新生细胞的数量[11]。

图2 两组各再灌注时间点Caspase-3表达比较 (×400)

近年来大量研究已证实脑缺血再灌注后有细胞凋亡出现，凋亡是基因控制的程序性级联过程，而Caspase家族在这个过程中起关键作用，其中Caspase-3与线虫的死亡基因ced-3同源性最高。在中枢神经系统中，Caspase-3不仅可以促进脑发育时期神经元的凋亡，还可促进各种因素诱导的成熟神经元的凋亡，是Caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用[12]。上述研究均说明Caspase-3可促使脑缺血后迟发性神经元死亡，其表达的量决定了最终梗塞灶的大小。

本研究发现，缺血再灌注损伤后可诱导Caspase-3表达增加，说明缺血再灌注损伤诱导了凋亡发生，氟西汀组相同再灌注时间点梗死体积明显减少，神经功能缺损评分降低，Caspase-3表达明显下降，表明Caspase-3参与了氟西汀介导的神经保护作用的调控。

综上所述，在本研究所考查因素范围内，预防性应用氟西汀能减轻SD大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，减轻神经功能缺损症状，缩小梗死体积，使缺血侧海马区Caspase-3表达减少。氟西汀具有神经保护作用，预防性应用氟西汀在脑缺血再灌注损伤急性期即起显著作用，这种神经保护作用可能与其减少Caspase-3的表达，从而下调凋亡基因的表达，抑制反应性凋亡来发挥其神经保护作用，但其抑制凋亡途径的具体机制还有待于进一步研究。

[1] Dowlatshahi D, MacQueen GM, Wang JF, et al. Increased temporal cortex CREB concentrations and antidepressant treatment in major depression[J]. Lancet, 1998, 352(9142): 1754-1755.

[2] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20(1): 84-91.

[3] Dam M, Tonin P, De Boni A, et al. Effects of fluoxetine and maprotiline on functional recovery in post-stroke hemiplegic patients undergoing rehabilitation therapy[J]. Stroke, 1996, 27(7): 1211-1214.

[4] 周波, 肖军, 吴景芬, 等. 氟西汀对脑卒中后非抑郁患者神经功能康复的影响[J]. 中国临床康复, 2003, 7(3): 374-375.

[5] 王占军, 陆兵勋, 姬仲. 氟西汀预处理对大鼠脑缺血再灌注海马区BDNF和bcl-2表达的影响[J]. 中国微侵袭神经外科杂志, 2005, 10(9): 414-416.

[6] Lim CM, Kim SW, Park JY, et al. Fluoxetine affords robust neuroprotection in the postischemic brain via its anti-inflammatory effect[J]. J Neurosci Res, 2009, 87(4), 1037-1045.[7] Cai D, Chen S, Glanzman DL. Postsynaptic regulation of long term facilitation in aplysia[J]. Curr Biol, 2008, 18(12): 920-925.

[8] Pleger B, Schwenkreis P, Grunberg C, et al. Fluoxetine facilitates use-dependent excitability of human primary motor cortex[J]. Clinical neurophysiology, 2004, 115(9): 2157-2163.

[9] Soares JC, Krishnan KRR, Keshavan MS. Nuclear magnetic resonance spectroscopy: New insights into the pathophysiology of mood disorders[J].Depression,1996,4(1):14-30.

[10] Chiou SH, Chen SJ, Peng CH, et al. Fluoxetine up-regulates expression of cellular FLICE-inhibitory protein and inhibits LPS-induced apoptosis in hippocampus-derived neural stem cell[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 343(2): 391-400.

[11] Kodama M, Fujioka T, Duman RS. Chronic olanzapine or fluoxetine administration increases cell proliferation in hippocampus and prefrontal cortex of adult rat[J]. Biol Psychiatry, 2004, 56(8): 570-580.

[12] Zhu C, Wang X, Xu F, et al. The influence of age on apoptotic and other mechanisms of cell death after cerebral hypoxia-ischemia[J]. Cell Death Differ, 2005, 12(2): 162-176.

Protective effect of fluoxetine pretreatment on focal cerebral ischemia reperfusion damage in SD rat

NIE Chen, GAO Zheng, SUN Wen-fang, ZHENG Rui-hong

(DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116031,China)

Objective To discuss the protective effect of fluoxetine pretreatment on focal cerebral ischemia reperfusion damage in SD rat. Methods Forty-eight healthy male SD rats were established ischemia-reperfusion model in right cerebral middle artery. They were randomly divided into 2 groups, control group and fluoxetine group. 0.9% sodium chloride (10 mL/kg·d) and fluoxetine 0.9% sodium chloride solution (2.0 mg/kg·d) was given respectively to control group and fluoxetine group by gastric gavage at the same time since the 14th day before ischemia-reperfusion.Each group was divided evenly into 3 subgroups according to reperfusion 2 h, 6 h, 24h after ischemia for 2 h. The neurologic impairment score, cerebral infarction volume, and Caspase-3 expression in the ischemia side of hippocampus tissue were compared between two groups. Results Comparing with control group, the neurologic impairment score and the infarction volume decreased in fluoxetine group at the same time point. There were no significant difference between two groups except in the group of reperfusion 24h following cerebral ischemia 2 h (P<0.01). The expression of Caspase-3 in the ischemia side of hippocampus tissue decreased at 3 time points of reperfusion in fluoxetine group than that in control group. Conclusion Fluoxetine could have a neuroprotective effect on cerebral ischemia-reperfusion. The protective effect could be related to inhibiting Caspase-3 expression.

fluoxetine; ischemia reperfusion; Caspase-3

10.11724/jdmu.2015.06.08

聂 琛(1982-), 女, 辽宁大连人, 主治医师。 E-mail: niechen216789@126. com

高 政, 教授。 E-mail: bygzyz@163. com

R971

A

1671-7295(2015)06-0552-04

聂琛，高政，孙文芳，等. 氟西汀预处理对SD大鼠脑缺血再灌注损伤的脑保护作用[J].大连医科大学学报，2015,37(6)：552-555，559.

2015-04-26；

2015-10-31)