拮抗细菌发酵提取物与井冈霉素混配对水稻纹枯病的毒力研究

彭双强，张 亚,3，廖晓兰,3，楚文琢，冯游滔

（1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2.植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南省生物农药与农药制剂加工工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

水稻纹枯病（Rhizoctonia solani），是影响我国水稻生长的常见病害，一般情况下水稻纹枯病会致使水稻减产10%～20%，严重时往往导致水稻倒伏枯死，减产量高达到50%～60%[1]，对我国农业生产造成了巨大的经济损失。然而，目前防治水稻纹枯病的有效药剂比较单一，主要是井冈霉素，该药剂自发现并应用至今已有40 a 以上历史[2]。由于长期使用，水稻纹枯病菌对井冈霉素产生了一定程度的抗药性[3]，单一的井冈霉素对水稻纹枯病的防效已明显减弱，使得每年使用的次数逐渐增多，使用量也显著增加[4-5]。因此，为了提高水稻纹枯病的防效，研发高效的新型药剂已迫在眉睫。

生物防治是一种高效、安全控制水稻纹枯病的方法。近10 a 来，国内外专家对水稻纹枯病拮抗菌进行了大量研究，取得了较大成果[6-9]，先后发现了芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）、放线菌（Actinomycetes）等常见的纹枯病拮抗菌[10-14]。然而，研究也表明单一的生物防治效果并不理想，常常表现出较大的变异。研究证实，将井冈霉素与拮抗细菌混配使用，能有效延缓病原菌的抗药性，提高对水稻纹枯病的防治效果。例如：陈菲等[15]发现枯草芽孢杆菌与井冈霉素混用防治水稻纹枯病具有增效效果；农倩等[16]报道称内生菌B196 菌株与井冈霉素混配能提高防治效果；陈志谊等[17]发现生防菌Bs-916 和井冈霉素混配可以协同防治水稻纹枯病。目前，关于利用拮抗细菌发酵液提取物与井冈霉素混配防治水稻纹枯病的报道在国内外较为少见。实验室从稻田养鸭生态系统的水稻根际土壤中分离了一株细菌SU8，经鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa），GenBank数据库收录号为HQ283487，研究发现该菌株对水稻纹枯病菌有较好的防治效果[18]。基于此，研究以SU8发酵提取物与井冈霉素为材料开展水稻纹枯病防治试验，以期拓宽对该病的防治途径，削弱病原菌对药剂的抗性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试药剂为60%井冈霉素可溶性粉剂（武汉科诺生物有限公司）；供试菌种为SU8 拮抗细菌，由湖南农业大学生物安全科学技术学院生物安全检测中心实验室筛选分离；水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani），由湖南农业大学生物安全科学技术学院提供。供试水稻为易感纹枯病品种皖稻68（湖南农业大学水稻研究所）。

主要仪器有立式压力蒸汽灭菌消毒器（上海申安医疗器械厂）；RE-52A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；HQZ-C 双层空气恒温震荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；HG303-3 型电热干燥培养箱（南京实验仪器厂）；AUX220 分析天平（岛津公司）；HPG-280B 光照培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；LYH-XX 干燥箱（济南鲁岳涂装烘干设备制造有限公司）；QHX-400BSH-Ⅲ人工气候箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；移液枪（德国 Eppendoff）；卫士牌WB-16 型背负式手动喷雾器（山东卫士植保机械有限公司）；研钵、打孔器、各种试剂瓶等实验室常用器材。

供试培养基有：（1）NA 培养基，牛肉浸膏10 g/L、蛋白胨 10 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂17 g/L、pH 值7.0；（2）NB 培养液，除不加琼脂外，其余同NA 培养基；（3）PDA 培养基，马铃薯200 g/L、葡萄糖15 g/L、琼脂 17 g/L、自然pH 值。上述培养基参考方中达[19]的方法制备。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗细菌SU8 发酵提取物的制备种子液：将拮抗细菌SU8 在NA 培养基上活化后，用无菌水做成菌体悬浮液，取10 m L 接种到装有100 m L NB 培养液的250 mL 锥形瓶中，在28℃的恒温条件下以220 r/min的速率震荡培养48 h，得到种子液。发酵液母液：种子液以10%的接种量接入装有300 m L NB 培养液的1 000 m L 锥形瓶中，磁力搅拌子转速为1 000 r/min，置28℃的振荡培养箱中连续培养84 h，获得发酵液。将发酵液和乙酸乙酯以1︰2 的比例充分混匀萃取48 h，取萃取液于40℃旋转蒸发仪中，以110 r/min 的转速旋转蒸发至膏状，获得抑菌物质，该抑菌物质即为SU8 发酵液乙酸乙酯提取物（以下简称SU8 发酵提取物），用相应的溶剂溶解，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 室内毒力测定 （1）最小抑菌浓度（M IC）测定。试验参照黄彰新[20]的菌丝生长速率法进行M IC测定。具体操作如下：在无菌条件下，将SU8 发酵液提取物和井冈霉素分别配制6种浓度，浓度分别为1 000、750、500、250、125、62.5 mg/L，4℃下保存备用；分别取配制的不同浓度的两种物质1.0 m L，加入9.0 m L 热培养基（以加1 m L 的水为对照），摇匀制成平板；接种生长一致的供试菌菌饼（直径5.0 mm），使菌饼带菌丝的一面贴在培养基表面，置于25℃的培养箱中恒温培养；待对照处理的菌丝长满培养皿时，采取十字交叉法[21]测定菌落直径，每个处理3 次重复；以不长菌处理中药剂的最低浓度为最小抑菌浓度（M IC）。（2）菌丝生长抑制率的测定。在最小抑菌浓度（M IC）试验的基础上，分别取SU8 发酵提取物与井冈霉素溶液按两者质量比为9︰1、4︰1、1︰1、1︰4 和1︰9 进行混合，每个配比设置5种不同的浓度梯度，配置好的溶液于4℃下保存备用；参照菌丝生长速率法计算药剂的菌丝生长相对抑制率，采用十字交叉法测定各处理的菌落直径，减去5 mm 的菌饼直径即为菌落生长直径，每个处理3 次重复。通过公式（1）计算药剂对菌丝生长的抑制率。（3）混配剂联合毒力的评价。参照Wadley[22]的增效比率法，以药液浓度对数值为自变量，以相对抑制的百分率的几率值为因变量，计算出毒力回归方程Y 和相关系数r，根据回归方程求出EC50值，并计算出理论的EC（th）50值，求出不同比例的混配的增效系数SR。

式中，A 为SU8 发酵提取物，B 为60%井冈霉素可溶性粉剂，a、b 分别为SU8 发酵提取物和60%井冈霉素可溶性粉剂在混配组合物总重量中的比例。

根据增效系数（SR）进行联合作用综合评价。当0.5＜SR ＜1.5 时，说明两种物质混配具有协同作用；当SR ≤0.5 时，说明两种物质混配表现出拮抗作用；当SR ≥1.5 时，说明两种物质混配有增效作用。

1.2.3 盆栽防病试验 2014年5月中旬～6月下旬，在口径为40 cm、高为25 cm 的花盆中装入无菌水稻土至盆高的2/3，取40 g 病原菌培养物均匀混于土壤中，每盆移栽生长状况较一致的易感病水稻品种皖稻68 幼苗20 株，置于温度26℃、湿度80%～90%的人工气候箱中培养，两盆之间的间距为10 cm，其他同常规管理。每天观察稻苗生长情况，于拔节孕穗期分别喷施质量比1︰9 和1︰4 的井冈霉素（500 mg/L）和SU8 发酵液（1 000 mg/L）混配剂，以相同浓度的井冈霉素和SU8 发酵液做对照试剂，以清水做空白对照，每个处理3 次重复。连续施药两次，两次施药之间间隔7 d，观察记录水稻植株的发病情况，并计算防效。按照相关文献的标准进行病害分级[23]。病情分级标准为：0 级，全株无病斑；1 级，第四叶片及其以下各叶鞘、叶片发病（以顶叶为第一张叶片）；3 级，第三叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；5 级，第二叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；7 级，剑叶及其以下各叶鞘、叶片发病；9 级，全株发病，提早枯死。

病情指数=[∑（各级病叶数×相对级数值）/（调查病叶数×最高级数值）]×100

防治效果（%）=（对照区病情指数－处理区病情指数）/对照区病情指数×100

2 结果与分析

2.1 最小抑菌浓度与菌丝生长抑制率

试验结果表明，60%井冈霉素和SU8 发酵提取物对水稻纹枯病菌的最小抑菌浓度分别为6.25 和25 mg/L；在最小抑菌浓度的基础上，设定的不同质量比混配的溶液对水稻纹枯病菌丝生长抑制率为14.3%～70.1%范围内。

2.2 单剂和混配剂对水稻纹枯病菌的室内毒力

利用菌丝生长速率法进行SU8 发酵提取物与井冈霉素混配的室内联合毒力测定，结果见表1。从表1 中可以看出，SU8 发酵液提取物单剂对水稻纹枯病菌的EC50为4 120.17 mg/L，井冈霉素可溶性粉剂单剂的EC50为404.81 mg/L。

SU8 发酵提取物和井冈霉素可溶性粉剂以质量比9︰1、4︰1、1︰1、1︰4 和1︰9 的混配，其增效系数分别为7.53、3.68、3.31、1.01 和1.81。其中，质量比为1︰4 混配的SR 大于0.5，而小于1.5，表现为协同作用；质量比为9︰1、4︰1、1︰1 和1︰9 混配的SR 均大于1.5，表现为增效效果，其中又以质量比为9︰1 的混配增效最明显。

表1 SU8 发酵提取物和井冈霉素单剂及其不同比例混合组配对水稻纹枯病菌的室内毒力

2.3 单剂和混配剂对水稻纹枯病的盆栽防效

由表2 可知，两次施药，单一的60%井冈霉素可溶性粉剂防病效果分别为70.2%和73.8%，单一的SU8 发酵提取物的防病效果分别为40.7%和39.6%，均低于同浓度两者质量比9︰1、4︰1 的混配剂的防病效果，且表现出极显著差异。

3 结论与讨论

目前，利用拮抗菌株的代谢产物防治水稻纹枯病的研究已有报道。如：王国平等[24]指出内生真菌紫杉木霉ZJUF0986 的发酵液提取物可以防治水稻纹枯病；陈志谊等[25]证实了拮抗细菌的分泌物拮抗素JK-b 对水稻纹枯病菌具有抑制作用；段桂芳等[26]发现了禾长蠕孢菌的代谢产物 Ophiobolin A 能防治水稻纹枯病；孙冬梅等[27]报道了黄绿木霉发酵液可以抑制水稻纹枯病菌。而有关利用拮抗菌株的代谢产物与井冈霉素混配防治水稻纹枯病的报道还较少见。

表2 SU8 发酵液提取物和井冈霉素不同比例混合组配对水稻纹枯病的盆载防效

该研究通过室内毒力测定试验，发现SU8 发酵液提取物和60%井冈霉素可溶性粉剂以质量比9︰1、4︰1、1︰1 和1︰9 的混合组配对水稻纹枯病菌的防治具有显著的增效作用，以质量比1︰4 的混合组配对水稻纹枯病菌的防治具有协同作用。盆栽试验也证实SU8 发酵液提取物和60%井冈霉素质量比为9︰1 和4︰1 的混合组配的防病效果高于单一的同浓度的井冈霉素。这表明与SU8 发酵提取物混配能显著增强井冈霉素对水稻纹枯病的防治效果，为提高井冈霉素对水稻纹枯病的防治效果提供了一定的理论依据，并为拓展拮抗细菌SU8 生物农药的应用提供了一条有效途径。此外，其增效机理、作用方式和田间防效还有待进一步研究。

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