星点设计-效应面法优化常春藤皂苷C提取工艺

曾建刚，孙化鹏，阮琴妹，程建宇，钟晓红

（湖南农业大学 园艺园林学院， 湖南 长沙410128）

洋常春藤（Hedera helix）为五加科常春藤属的一种多年生常绿攀援藤本植物，全株可入药[1]。现阶段研究表明其主要功能成分是皂苷类化合物[2]。该类化合物具有保肝、抗肿瘤、镇静、止痛等多种药理活性[3-5]。欧洲药典和英国药典均已收录洋常春藤作为植物药，其评价标准是洋常春藤干燥叶片中常春藤皂苷C 的含量不低于3%[6-8]。洋常春藤在我国分布广泛，目前国内对洋常春藤的研究主要集中在培育、繁殖等方面[9-10]，而对于其功能成分的研究甚少，使得洋常春藤资源的利用率不高。因此，加快洋常春藤功能成分的深入研究和开发，提高洋常春藤的综合利用价值，对于丰富我国药用植物的研究具有十分深远的意义。

近年来国内多采用均匀设计或正交设计法优化植物有效成分的提取工艺，这两种设计方法均采用线性数学模型，虽然简便、试验次数少，但其精度不高。星点设计（CCD）[11-12]是在析因设计的基础上采取非线性数学模型进行拟合分析，其复相关系数相对较高，预测值更精确，并具有试验次数较少、结果直观等优点[13-14]。本实验采用CCD 法，并结合效应面法优化洋常春藤皂苷C 的提取工艺，为洋常春藤皂苷C 的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：洋常春藤鲜叶于2014年8月采自湖南省长沙市，洗净后置于鼓风干燥箱中60℃烘干至恒重，粉碎后过60 目筛，密封保存备用。

试剂：乙腈、磷酸为色谱纯，乙醇为分析纯，超纯水（自制）。常春藤皂苷C 标准品（纯度≥98%）购于南京春秋生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

Shimadzu 高效液相色谱仪，包括Shimadzu SPD20A 检测器、Shimadzu SIL20A 自动进样器、Shimadzu L C Solutions 工作站；数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；AL204 电子天平（梅特勒–托利多上海有限公司）；高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制造机械有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 HPLC 法测定常春藤皂苷C 含量 具体步骤如下：

（1）HPLC 检测法色谱条件的选择。选择C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)。二元高压梯度洗脱：0～35 m in，20%～50%A；35～40 m in，50%～60%A。检测波长210 nm，流速1.0 m L/m in，进样量20 μL，柱温25℃。

（2）标准品溶液的制备。精密称取常春藤皂苷C标准品5.1 mg，甲醇溶解定容至5 m L，配成浓度为1.02 mg/m L 的储备液。

（3）标准曲线的制作。分别将标准品溶液用甲醇稀释1、2、3、4、5 倍，摇匀，按（1）项下色谱条件进样检测。以标准品常春藤皂苷C 的浓度（mg/m L）为横坐标，以色谱的峰面积作为纵坐标，绘制常春藤皂苷C浓度的标准曲线。

（4）常春藤皂苷C 含量的测定。取制备好的样品溶液，按（1）项下色谱条件测定峰面积，根据标准曲线换算出常春藤皂苷C 的含量，从而计算常春藤皂苷C得率。

1.3.2 提取工艺的优化 通过单因素试验和星点试验设计，进行模型拟合与数据处理，以提取优化的工艺。

（1）单因素试验。精密称取洋常春藤粉末3.0 g 于200 m L圆底烧瓶中，加入60 m L 一定浓度的乙醇，选取50℃、60℃、70℃、80℃、90℃不 同 水 浴 温 度；10 m in、20 m in、40 m in、60 m in、80 m in 不同提取时间；1、2、3、4、5 不同提取次数；30%、45%、60%、75%、90%不同乙醇浓度进行回流提取，过滤，合并滤液，按1.3.1（4）的方法测定常春藤皂苷C 的含量，并计算出常春藤皂苷C 的得率。

（2）星点试验设计。为了更精确地研究各因素的最佳水平值，在单因素试验结果分析的基础上，取回流温度（x1）、乙醇浓度（x2）、提取时间（x3）作为自变量，设定因素水平表，见表1。因提取次数为非连续的变量，不能够进行回归处理，结合单因素实验和生产实际，均设定为两次。称取常春藤粉末3.0 g 于200 m L圆底烧瓶中，加入60 m L 一定浓度的乙醇，置于水浴锅中回流提取，过滤，合并滤液，HPLC 法测定溶液中常春藤皂苷C 含量。

（3）模型拟合与数据处理。本实验使用Design–Expert 8 软件进行数据分析。采用效应面分析方法，进行多元线性回归及二项式拟合，并对拟合出的较优方程模型进行方差分析。以拟合方程的r 和P 值为指标，选择P 和r 较佳的方程作为模型。依据模型方程来绘制响应面三维立体图及等高线。因为效应曲面图为三维图，只能表示出其中两个自变量的函数，所以，分别固定3个自变量中的一个为中值，在拟合目标函数的基础上，绘制因变量三维立体效应面图。利用该效应面三维图对任意2个自变量的交互作用进行分析及评价。利用Design-Expert 8 软件中Optimization模块的Point Prediction 功能分析预测最佳提取工艺条件，并进行验证实验，最终得出常春藤皂苷C 的最佳提取工艺条件。

表1 星点设计因素与水平

2 结果与分析

2.1 常春藤皂苷C 的HPLC 检测法的建立

通过不断调整流动相比例，在1.3.1（1）项下二元高压梯度洗脱时，样品溶液色谱图基线平稳，不同组分分离度较好，由此确定常春藤皂苷C 的HPLC 检测法的色谱条件。

得常春藤皂苷C 浓度的标准曲线方程为：Y=1.7×106X-7 972.3，R2=0.999 3。结果表明，常春藤皂苷C 的浓度与峰面积线性关系良好，HPLC 法测定常春藤皂苷C 的含量有效可行。

2.2 提取工艺的优化结果

2.2.1 单因素试验结果 单因素试验结果如图1，由图1 可知，常春藤皂苷C 提取的最佳单因素实验条件为：回流温度70℃，乙醇浓度75%，提取时间70 min，提取次数由于2 次后变化不大，考虑工业生产成本和实际，均定为2 次。在上述最佳单因素条件下，常春藤皂苷C 最佳得率为3.51%。

2.2.2 星点设计试验结果 根据单因素实验结果，确定星点设计因素范围。由于非连续变量不能够进行回归处理，综合考虑生产实际，提取次数均设定为2 次，星点设计试验结果见表2。

2.2.3 模型拟合与效应面分析

（1）模拟方程。用Design–Expert 8 软件进行数据分析，以因变量分别对自变量进行多元线性回归和二项式拟合。所得常春藤皂苷C 得率的线性回归方程为：

y=2.685 51＋0.004 22x1＋0.003 16x2＋0.002 89x3(r=0.135 4，P>0.05)。拟合度较差，模型不合格，因此多元线性模型不合适。

图1 温度（A）、乙醇浓度(B)、提取时间(C)、提取次数(D)对常春藤皂苷C 提取得率的影响

表2 星点设计试验结果

得到常春藤皂苷C 得率非线性二次方程为：

y=－0.477 28＋0.019 985x1＋0.092 326x2＋0.011 827x3＋3.64×10-6x1x2－6.20×10-6x1x3＋9.06×10-5x2x3－1.21×10-4x12－7.79×10-4x22－1.55×10-4x32(r=0.984 5，P＜0.01)

由上述方程可知，二项式方程的r 值要高于线性方程，且P＜0.01，表明二项式方程具有高度的显著性，模型与实际拟合较好，实验误差小，利用星点设计来优化常春藤皂苷C 的提取是可行的。对二项式方程的回归模型进行显著性检验，方差分析结果见表3。结果表明，方程的一次项对常春藤皂苷C 得率的线性效应均表现为极显著（P＜0.01）；二次项中，各个因素对常春藤皂苷C 得率的曲面效应影响均显著；其中x2x3的P＜0.05，说明乙醇浓度与提取时间交互作用显著，其他因素间的交互作用不显著。

（2）效应面分析。根据二项式方程，固定3个自变量之一为中值，应用Design–Expert 8 软件作三维效应面图（图2～图4），由图2～图4 可以看出，3个因素对常春藤皂苷C 得率的影响顺序是：乙醇浓度>提取时间>回流温度。乙醇浓度与提取时间这2个因素间的交互作用显著，回流温度与乙醇浓度、提取时间之间的交互作用影响不显著。常春藤皂苷C 得率的较佳工艺范围为乙醇浓度60%～70%，回流温度70～85℃，提取时间45～60 m in。通过软件分析，得出回归模型的最大值点，即常春藤皂苷C 的最佳提取工艺条件为乙醇浓度62.6%，回流温度82.3℃，提取时间54.7 m in，回流提取2 次。在此条件下，常春藤皂苷C的预测得率为3.56%。

表3 拟合二项式方程方差分析

图2 乙醇浓度与回流温度对常春藤皂苷C 得率的效应面图

图3 提取时间与回流温度对常春藤皂苷C 得率的效应面图

图4 提取时间与乙醇浓度对常春藤皂苷C 得率的效应面图

（3）优化结果的验证。按照得出的最佳提取工艺条件进行5 次验证试验，结果表明，最佳工艺提取的常春藤皂苷C 得率的平均值为3.52%。其结果与拟合方程的预测值3.56%较吻合，偏差值为0.04个百分点。表明所建立的数学模型具有良好的预测性，由数学模型所得的最佳条件与设计目标相符合。

3 讨论

本实验通过采用星点设计- 效应面法得出了回流温度、乙醇浓度、提取时间对常春藤皂苷C 的效应趋势，优化了常春藤皂苷C 的提取工艺。充分考虑到了各因素间的交互作用，设计方法简便，精度高，试验次数少。并且此方法模型拟合的复相关系数较高，可信度好，结果直观，便于分析。经过验证，该方法优化常春藤皂苷C 提取准确可行。

通过回归分析和验证，得到常春藤皂苷C 最佳提取工艺条件乙醇浓度62.6%，回流温度82.3℃，提取时间54.7 min，回流提取2 次。在此条件下，常春藤皂苷C 的得率为3.52%，该得率比单因素实验中最佳得率更高，且提取成本降低，说明方程模型有较好的应用价值。利用星点设计-效应面法优化常春藤皂苷C提取是有效可行的。该研究可为常春藤皂苷C 的工业化生产提供参考依据，有效提高原料利用率。

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