基于ITS、psbA-trnH及matK序列的罗布麻资源分子系统学研究△

谭秀芳，樊丛照，李晓瑾，*，李阳，辛雅仙

(1.新疆医科大学 药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002)

·专题·

基于ITS、psbA-trnH及matK序列的罗布麻资源分子系统学研究△

谭秀芳1，樊丛照2，李晓瑾1，2*，李阳1，辛雅仙1

(1.新疆医科大学 药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002)

目的：从分子生物学角度研究罗布麻属植物种间差异，为确定《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》中的植物基原提供依据。方法：采用DNA条形码ITS、psbA-trnH及matK序列对罗布麻、白麻及大叶白麻55份样品进行PCR扩增并双向测序，比较种内种间变异，基于K2P模型进行遗传距离分析，并构建NJ系统树。结果：罗布麻、白麻及大叶白麻ITS序列种内及种间K2P遗传距离无显著差异，NJ树聚为一支；罗布麻与白麻及大叶白麻之间psbA-trnH和matK序列种内最大K2P遗传距离明显小于种间最小K2P遗传距离，NJ树显示罗布麻与白麻及大叶白麻均单独聚为一支；白麻与大叶白麻psbA-trnH和matK序列无差异，NJ树均为一支。结论：基于ITS、psbA-trnH及matK序列鉴定结果，《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》将药材罗布麻的基原定为大叶白麻Poacynumhendersonii值得商榷。

罗布麻；DNA条形码；基原；ITS；psbA-trnH；matK

罗布麻ApocynumvenetumLinn.系夹竹桃科Apocynaceae罗布麻属多年生宿根草本植物，药用部位为花和叶，具有抗氧化、降压、抗抑郁、强心、抗菌等作用[1-2]。《中华人民共和国药典》2010版及《新疆维吾尔自治区中药维吾尔药饮片炮制规范》中收载“罗布麻”基原为罗布麻A.venetum[3-4]，《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》收载“罗布麻”基原则为大叶白麻Poacynumhendersonii(俗称大花罗布麻)[5]。而植物学界对罗布麻基原的种属存有争议，在《中国植物志》中将罗布麻A.Venetum归在罗布麻属，白麻P.pictum及大叶白麻P.hendersonii则归白麻属[6]，Flora of China(植物分类数据库)则取消了白麻属，将白麻P.pictum归入罗布麻属，而未记载大叶白麻P.hendersonii[7]。这种学术分歧直接影响《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》对罗布麻基原表述的权威性和准确性，因此，进一步明确罗布麻种属，对维吾尔药材标准的制定及维吾尔药材的标准化、现代化具有重要的意义。

DNA条形码鉴定技术[8]应用于物种鉴定已成为植物学界共识，Kress等[9-10]建议将核基因ITS序列及叶绿体间隔区psbA-trnH作为条形码，对开花植物进行鉴定；中国植物条形码工作组建议将ITS/ITS2作为种子植物核心条形码[11]；陈士林等[12-14]建立了以ITS/ITS2为主体，psbA-trnH为辅的中药材鉴定体系，Lahaye等[15-17]证明叶绿体基因matK序列在某些类群中种间、种下的系统进化研究提供了一定的价值。张卫明等[18-19]基于ITS、trnL和trnL-F序列，鉴定了罗布麻、白麻及大叶白麻。ITS序列不能将三者区分；trnL和trnL-F序列可区分罗布麻与白麻。为进一步明确罗布麻各种之间的关系，本研究采用DNA条形码ITS、psbA-trnH及matK序列，进一步检测、分析三者之间的差异，为明确维吾尔药材罗布麻的基原，提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究的55份实验样品叶片收集于新疆各地及药材市场，样品由新疆维吾尔自治区中药民族药研究所王果平副研究员鉴定。凭证标本保存于新疆中药民族药研究所标本馆(新疆XTNM)，实验所获得的单倍型序列已提交至GenBank，详见表1。

表1 实验材料信息

表1(续)

1.1.1 试剂 PCR扩增所用引物由上海生工生物工程合成，DNA提取试剂盒、DNA聚合酶及dNTP等均购自天根生化科技有限公司。

1.1.2 实验仪器 DNA提取研磨仪(GT-100)，北京格瑞德曼仪器设备有限公司；离心机(Anker TGL-16C)，上海安亭科学仪器；PCR扩增仪(070-851PCR)，德国An Analytik Jena公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及检测 称取干燥叶片30 mg，DNA提取研磨仪1 000r·min-1研磨2 min，植物DNA提取试剂盒提取总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。

1.2.2 PCR扩增及测序 ITS、psbA-trnH及matK序列PCR扩增引物、反应体系及反应条件参见《中药DNA条形码分子鉴定》[20]，PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测并纯化后，使用ABI 3730 XL(Applied Biosystems Co.，USA)测序仪进行双向测序。

1.3 数据处理

测序峰图用CodonCode Aligner V 4.0.4(Codon Code Co.，USA)校对拼接，去除引物区。将所有序列由软件MEGA5.1(molecular evolutionary genetics

analysis)分析比对[21]，基于K2P模型分析种内和种间变异[22]。选择不同单倍型序列，用邻接(NJ)法构建系统聚类树，使用bootstrap(1000次重复)检验各分支的支持率[23]。

2 结果

2.1 序列信息及变异结果

罗布麻、白麻和大叶白麻实验样本的ITS序列长度变化范围为689-692 bp，单倍型数分别为7、11、6，GC含量为61.0～61.3%；psbA-trnH序列长度变化范围为301-323 bp，单倍型数分别为3、5、1，GC含量为34.4～36.5%；matK序列长度均为838-840 bp，单倍型数分别为3、4、1，GC含量为34.2%～34.6%，详见表2。

表2 样品ITS、psbA-trnH及matK序列特征

2.2 种内及种间K2P距离分析

罗布麻、白麻及大叶白麻种内K2P距离如表3所示，罗布麻ITS序列种内最大K2P距离为0.004，平均值为0.001 3；白麻ITS序列种内最大K2P距离为0.003，平均值为0.001；大叶白麻种内最大K2P距离为0.004，平均值为0.001。罗布麻psbA-trnH序列种内最大K2P距离为0.003，平均值为0.002；白麻psbA-trnH序列种内最大K2P距离为0.007，平均值为0.004；大叶白麻psbA-trnH序列种内无变异。罗布麻matK序列种内最大K2P距离为0.001，平均值为0.0006；白麻matK序列种内最大K2P距离为0.006，平均值为0.003；大叶白麻matK序列种内无变异。

表3 ITS、psbA-trnH及matK序列种内K2P距离比较

罗布麻与白麻种间ITS序列种间最小K2P距离为0，平均值为0.009；罗布麻与大叶白麻ITS序列种间最小及平均K2P距离均为0.007；白麻与大叶白麻ITS序列种间最小K2P距离为0，平均值为0.002。罗布麻与白麻种间psbA-trnH序列种间最小K2P距离为0.007，平均值为0.009；罗布麻与大叶白麻psbA-trnH序列种间最小及平均K2P距离均为0.004；白麻与大叶白麻psbA-trnH序列种间最小K2P距离为0，平均值为0.002。罗布麻与白麻种间matK序列种间最小K2P距离为0.004，平均值为0.006；罗布麻与大叶白麻matK序列种间最小K2P距离为0.004，平均值为0.005；白麻与大叶白麻matK序列种间最小K2P距离为0，平均值为0.002，详见表4。

2.3 DNA条形码ITS、psbA-trnH、matK序列种内及种间变异结果

实验样本的ITS序列总变异位点数为18，包括13个碱基变异及5个插入/缺失变异，罗布麻、白麻及大叶白麻种内变异位点数分别为5、11、7(图1)；psbA-trnH序列中总变异位点数为27，包括4个碱基变异和23个插入/缺失变异，罗布麻、白麻及大叶白麻种内变异位点数分别为2、2、0，罗布麻与白麻、大叶白麻在178 bp位点的A-C及287 bp位点的G-A存在信息变异位点(图2)；matK序列中总变异位点数为11，均为碱基变异，罗布麻、白麻及大叶白麻种内变异位点数分别为2、5、0，87 bp位点的C-A变异、472 bp位点的C-T变异及495 bp位点的G-T变异为信息变异位点(图3)。

表4 ITS、psbA-trnH及matK序列种间K2P距离比较

图1 不同单倍型ITS序列种内种间变异

图2 不同单倍型psbA-trnH序列种内种间变异

图3 不同单倍型matK序列种内种间变异

2.4 罗布麻及白麻属NJ树鉴定结果

基于ITS序列构建的NJ树，罗布麻、白麻与大叶白麻聚为一支(图4)；基于psbA-trnH及matK序列构建的NJ树聚为两支，罗布麻单独为一支，而白麻与大叶白麻聚为一支(图5、图6)。

图4 基于ITS序列的NJ鉴别树，在图中显示分支支持率(≥50%，bootstrap 1 000次重复)

图5 基于psbA-trnH序列的NJ鉴别树，在图中显示分支支持率(≥50%，bootstrap 1 000次重复)

图6 基于matK序列的NJ鉴别树，在图中显示分支支持率(≥50%，bootstrap 1 000次重复)

3 讨论

3.1标准基因片段的选择是建立物种DNA条形码的关键。基于核糖体ITS序列的高度变异性及长度保守性，已被广泛用于系统发育及亲缘关系的研究[24]。陈士林等[25]对不同候选DNA条形码进行筛选，结果表明叶绿体序列psbA-trnH在物种水平和属水平鉴定效率远高于叶绿体其他条形码候选序列。matK基因位于叶绿体trnK基因的内含子中，是叶绿体基因组的蛋白编码区中进化最快的基因之一，为种间及种下的系统进化研究提供了一定的价值[26-27]。因此，本研究将ITS、psbA-trnH及matK作为候选序列。

3.2DNA提取和PCR扩增的稳定性是DNA条形码技术应用的前提。可从不同产地及不同批次的样品中均能稳定的获取DNA条形码序列是DNA条形码应用的基础[28]，罗布麻药用部位为叶片，与本研究样本取材一致，有利于本研究55份实验样品的DNA提取及PCR扩增，为顺利获得ITS、psbA-trnH及matK序列奠定基础。

3.3ITS鉴定结果显示：罗布麻与白麻、大叶白麻具有亲缘关系，可能是源于种间杂交或自然变异演变为不同的种下等级，因此，新疆等地民间以白麻入药具有一定依据[1，29]。罗布麻与白麻及大叶白麻的psbA-trnH及matK序列种内最大K2P距离小于种间最小K2P距离，能准确鉴定罗布麻与白麻及大叶白麻，为罗布麻药材的准确客观鉴定提供新的技术手段，有利于药材市场的监测和管理。而白麻与大叶白麻的 ITS、psbA-trnH及matK序列无差异，所以，《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》将“罗布麻”的基原定为大叶白麻P.hendersonii值得商榷。

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MolecularSystematicsStudyofApocynumResourcesBasedonITS，psbA-trnHandmatKSequences

TANXiufang1，FANCongzhao2，LIXiaojin1，2*，WANGQiang，LiYang1，XINYaxian1

(1.CollegeofPharmacy，XinjiangMedicalUniversity，Urmqi830011，China；2.XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthnicalMateria，Urumqi830002，China)

Objective：The difference ofApocynumgenus plants were studied by molecular method to provide evidence for formulating standard of the original plants of Uyghur medicine “Lubuma”.Methods：Fifty-five samples ofApocynumvenetum，PoacynumpictumandP.hendersoniiwere amplified and bidirectionally sequenced，and the intra-and interspecific variations were compared by three DNA barcodes(ITS，psbAtrnHandmatK).Genetic distances were caculated and NJ trees were constructed based on kimura 2-parameter (K2P) model.Results：The intra-and interspecific variations of ITS sequences showed no significant differences between three species，and they clustered as one clade in the NJ trees.The intraspecific genetic distances were lower than the interspecific genetic distances betweenA.venetumand other two species，and the species ofA.venetumcould be easily distinguished from the other two species by NJ-trees.No significant difference was found betweenP.pictumandP.hendersoniion either variable sites or NJ-trees.Conclusion：It is questionable thatP.hendersoniiwas scheduled as original plant of Uyghur medicine “Lubuma” in "Uygur Medicine Standard of Xinjiang Uygur Autonomous Region" according to this research.

Apocynumvenetum；DNA barcode；original plants；ITS；psbA-trnH；matK；

2014-12-17)

乌鲁木齐市科技局科技攻关项目(G121120004)

*

李晓瑾，研究员，研究方向：中药资源学；Tel：(0991)2665614，E-mail：xjlxj@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.002