金银花尺蠖及棉铃虫的一种病原真菌鉴定△

马维思，徐常青，张金良，董杰，乔海莉，郭昆，徐荣，陈君*，张大勇

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.云南省农业科学院药用植物研究所，昆明 650205；3.北京市植物保护站，北京 100029；4.加多宝集团种植资源部，北京 100176)

·中药农业·

金银花尺蠖及棉铃虫的一种病原真菌鉴定△

马维思1,2，徐常青1，张金良3，董杰3，乔海莉1，郭昆1，徐荣1，陈君1*，张大勇4

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.云南省农业科学院药用植物研究所，昆明 650205；3.北京市植物保护站，北京 100029；4.加多宝集团种植资源部，北京 100176)

目的：明确金银花上的棉铃虫、金银花尺蠖2种害虫的病原真菌的分类地位，为寻找对药材鳞翅目害虫有高毒力的病原真菌提供材料。方法：通过分生孢子分离、培养，从受真菌侵染死亡的金银花鳞翅目害虫体表分离获得昆虫病原真菌，依据真菌的形态特征和ITS序列特征对其进行鉴定。结果：从12份受真菌感染死亡的幼虫体表分离到12株形态特征一致的真菌，依据形态特征和ITS序列特征将其鉴定为莱氏野村菌Nomurearileyi。结论：莱氏野村菌为金银花尺蠖及棉铃虫两种金银花鳞翅目害虫的一种病原真菌，因其能够在某些鳞翅目害虫间形成流行病，对防治药材害虫具有应用潜力。

金银花；金银花尺蠖；棉铃虫；莱氏野村菌

金银花LonicerajaponicaThunb是我国常用大宗中药材，具有清热解毒，凉散风热、抗菌及抗病毒等功效[1]，在栽培过程中受到多种害虫的危害，其中鳞翅目害虫金银花尺蠖Heterolochajinyinhuaphaga、棉铃虫Helicoverpaarmigera的危害比较严重，金银花尺蠖在河南封丘一度成为危害金银花的主要害虫[2]，棉铃虫取食金银花花蕾及幼嫩叶片，影响药材的生产[3]。昆虫病原真菌是生物防治药材害虫的理想材料，对保障药材质量、产量和产区生态环境具有重要意义。国际上利用昆虫病原真菌防治飞蝗以及按蚊等农林、卫生害虫已经取得较大成功[4-5]，国内使用真菌杀虫剂防治蝗虫及椰心叶甲等害虫也取得了较好的效果[6-7]，目前至少有11种虫生真菌制成的杀虫剂被注册[8]，但关于利用昆虫病原真菌防治药材害虫的研究与应用的报道还很少。本研究采集到12批受真菌感染死亡的金银花鳞翅目害虫的幼虫，对其病原真菌进行分离鉴定，以期为进一步利用昆虫病原真菌防治金银花等药材的害虫提供基础。

1 材料

幼虫：从山东省临沂市平邑县的12株金银花上，采集到受真菌侵染死亡的12批鳞翅目幼虫，编号为SD1～SD12，经中国医学科学院药用植物研究所陈君研究员鉴定，除编号SD5的幼虫为尺蛾科昆虫金银花尺蠖外，其余11批幼虫均为夜蛾科昆虫棉铃虫。

PPDA培养基：200 g马铃薯去皮切块浸煮，滤除残渣，20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，17 g琼脂，加水定容至1 L，121 ℃高压湿热灭菌20 min，冷却至50～60 ℃时，加入硫酸链霉素(30 mg·L-1)和青霉素钾(30 mg·L-1)。

SDY液体培养基：10 g酵母浸膏，10 g蛋白胨，40 g葡萄糖，加水定容至1 L，121 ℃高压湿热灭菌20 min。

主要试剂：Fungal DNA mini Kit真菌DNA提取试剂盒购自美科美(北京)生物医学科研中心；Taq Plus DNA Polymerase(含预混Mg2+的10倍PCR缓冲液)购自天根生化科技(北京)有限公司，真菌ITS通用引物ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′)与ITS5(5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′)由上海生工合成。

2 方法

2.1 昆虫病原真菌的分离

2011年9月从山东临沂市平邑县的金银花基地的12株金银花上，分别采到12批被真菌感染致死的鳞翅目幼虫，12批幼虫编号为SD1～SD12。在显微镜下观察，所有受真菌感染死亡的幼虫症状一致，表面所着生的真菌孢子颜色、形态也一致，因此从每批染病幼虫中选一头进行病原真菌分离。用无菌水冲洗僵虫表面获得真菌孢子液，血球计数板计数，将孢子液浓度稀释成1×104孢子/mL，取10 μL接种到PPDA平板中央并均匀涂布。平板置于25 ℃的真菌培养箱中，自然光照培养，待真菌长出后，将形态不同的菌落挑到新的平板上接种纯化，直至获得单一菌落。

2.2 昆虫病原真菌的形态鉴定

将分离到的病原菌接种到PPDA培养基上，观察菌落特征，待其开始产孢时，挑取产孢菌丝，在显微镜下观察，根据真菌菌落特征、孢子形态及孢子发生方式进行形态鉴定。

2.3 昆虫病原真菌的分子鉴定

2.3.1 菌丝体制备与DNA提取 分离到的病原菌接种到PPDA试管斜面上，25 ℃恒温培养2周后，长出大量橄榄绿色的孢子。向试管中注入1 mL灭菌1%吐温80溶液，振荡使孢子悬浮，将孢子悬浮液倒入含40 mL SDY液体培养基的三角瓶中，25 ℃、140 r·min-1摇瓶培养72 h。取8 mL菌液于10 mL离心管中，10 000 r·min-1离心10 min，去上清，用灭菌滤纸吸去菌丝沉淀上的培养液，加液氮研磨菌丝，根据Fungal DNA mini Kit试剂盒的说明书提取真菌DNA，用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。

2.3.2 ITS序列扩增、测序及序列分析 50 μL PCR反应体系包含：10 μmol·L-1的ITS4、ITS5引物各2 μL，10 mmol·L-1的dNTP 1 μL，2.5 U/μLTaqDNA聚合酶1 μL，10倍上样缓冲液5 μL，100 ng·μL-1SD3菌株的DNA模板1 μL，灭菌双蒸水38 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性1 min，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃补平5 min，4℃终止反应。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，获得清晰的单一条带，送交中国农业科学院作物科学研究所重大科学工程开放实验室进行双向测序，测序结果在NCBI上进行比对，以确定昆虫病原菌的分类地位。

3 结果与分析

3.1 病原真菌的分离

从金银花植株上采集的鳞翅目幼虫，虫体上已经布满白色的菌丝和绿色的孢子。

A.金银花上的棉铃虫僵虫；B.金银花尺蠖僵虫；C.病原菌菌落正面；D.病原菌菌落背面图1 僵虫与病原菌菌落形态

用无菌水从虫体上冲洗真菌孢子，涂布PPDA平板培养，只长出一种菌落形态的真菌，取其分生孢子接到新的PPDA培养基上，4 d后长出肉眼可见的菌落，菌落呈白色、潮湿，随着菌丝的生长和菌落的扩大，菌落逐渐变得干燥，并从中间向外形成放射状的沟纹或环状的波纹，菌落背面呈红褐色，有皱裂。培养两周左右，在菌落中部呈环状产生绿色的孢子，并逐渐朝内、外蔓延，最终整个菌落由白色变为橄榄绿色。从12份僵虫上分离的真菌菌落形态一致。

3.2 昆虫病原真菌的鉴定

如图2，显微镜下观察，真菌孢子呈橄榄绿色、广椭圆形，分生孢子梗长出成轮的小梗，短圆形，小梗上着生瓶状体，甁状体上产生成串的分生孢子。根据病原菌感染昆虫的病症、菌落的特征、分生孢子形态及其发生方式，依据《昆虫病理学》[9]对昆虫病原真菌的描述，初步将分离到的昆虫病原真菌鉴定为莱氏野村菌Nomurearileyi。

A.分生孢子梗；B.分生孢子小梗上着生的瓶状体；C.分生孢子；D.莱氏野村菌形态(《昆虫病理学》1994)图2 昆虫病原菌形态特征

形态观察发现，从12份僵虫中分离出的真菌形态特征一致。选取编号SD3的菌株作为代表进行分子鉴定，ITS扩增片段测序后获得555 bp的序列。在NCBI网站进行序列比对，与SD3的ITS序列同源性最高的15株菌均为莱氏野村菌Nomuraearileyi，同源性为99%～100%。选SD3与10株莱氏野村菌及ITS序列同源性较高的普可尼亚属Pochonia、绿僵菌属Metarhizium、虫草属Cordyceps真菌各1株的ITS序列，利用MEGA5软件的NJ法构建系统发育树，结果如图3，SD3与莱氏野村菌的关系最为密切，与形态鉴定的结果一致，因此可将感染金银花尺蠖及棉铃虫的病原真菌确定为莱氏野村菌Nomuraearileyi。

图3 基于菌株SD3 rDNA ITS序列的系统发育树

4 讨论

昆虫病原真菌是进行害虫生物防治的重要资源，包括大约100属、800多种真菌[10]，近年来昆虫病原真菌的研究受到越来越多的关注，其中绿僵菌Metarhizium已经在非洲、澳大利亚被成功大面积应用于防治蝗虫，我国也在草原上开展利用绿僵菌防治草原蝗虫的研究[11]。相比大量在草业、林业、卫生以及粮食作物生产领域开展的利用昆虫病原真菌进行害虫生物防治的研究，鲜有利用昆虫病原真菌防治药材害虫的报道，随着绿色药材生产理念的发展，有必要探索研究既能够减少甚至替代化学农药使用，又能保证药材生产的新型真菌杀虫剂。莱氏野村菌能寄生多种鳞翅目害虫，对夜蛾科(如棉铃虫、大豆夜蛾、黎豆夜蛾、粉纹夜蛾、斜纹夜蛾等)害虫的致病力很强，且能够在田间引起疾病流行[9]，具有较高的应用潜力和研究价值。莱氏野村菌的有效成分为分生孢子，其生产需要苛刻的营养和持续光照条件，限制了大规模生产，因此，在大量收集、筛选具有高毒力的莱氏野村菌菌株的同时，应该加强其孢子发酵生产的工艺研究。微菌核(microsclerotium)是莱氏野村菌的一种抗逆性极强的休眠结构，由特化的菌丝缠绕而成，可以抵御不良环境，有可能作为一种替代分生孢子的有效成分[12]。真菌杀虫剂的使用效果容易受到环境湿度、温度、光照等因素的影响，因此，只有开发出合适的制剂，并选择恰当的时间，在环境条件合适的区域合理地使用才可能取得理想的防治效果。

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[2] 王广军，张国彦，王江蓉.金银花尺蠖的发生规律与防治技术[J].中国植保导刊，2005.25(003)：22-23.

[3] 任应党，刘玉霞，申效诚，等.金银花主要害虫及防治[J].河南农业科学，2004(09)：66-68.

[4] Thomas M B，Read A F.Can fungal biopesticides control malaria?[J].Nature Reviews Microbiology，2007，5(5)：377-383.

[5] Scholte E J，Knols B G J，Takken W.InfectionofthemalariamosquitoAnophelesgambiaewiththeentomopathogenicfungusMetarhiziumanisopliaereduces blood feeding and fecundity[J].Journal of invertebrate pathology，2006，91(1)：43-49.

[6] Peng G，Wang Z，Yin Y，et al.FieldtrialsofMetarhiziumanisopliaevar.acridum(Ascomycota：Hypocreales)againstorientalmigratorylocusts，Locustamigratoriamanilensis(Meyen)in Northern China[J].Crop Protection，2008，27(9)：1244-1250.

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[8] 王滨，李增智，姚剑.真菌杀虫剂产业的发展现状·趋势与对策[J].安徽农业科学，2010(012)：6269-6270..

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[12] 姜莎莎.RacA与Cdc42调节双型真菌莱氏野村菌的极性生长和微菌核形成[D].重庆大学，2014.

Identification of Entomopathogenic Fungi fromHeterolochajinyinhuaphagaandHelicoverpaarmigeraDamagingLonicerajaponicaThunb

MA Weisi1,2，XU Changqing1，ZHANG Jinliang3，Dong Jie3，QIAO Haili1，GUO Kun1，XU Rong1，CHEN Jun1，ZHANG Dayong4

(1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Institute of Medicinal Plants，Yunnan Academy of Agriculture，Kunming 650205，China；3 Beijing Plant Protection Station，Beijing 100029，China；4.Department of Plant Resources of The JDB Group，Beijing 100176，China)

Objective：To identify the entomopathogenic fungi which killingHeterolochajinyinhuaphagaandHelicoverpaarmigeradamagingLonicerajaponicaThunb.Methods：Eleven samples ofHeterolochajinyinhuaphagaand one sample ofHelicoverpaarmigeralepidoptera larvae infected by entomopathogenic fungi were collected fromLonicerajaponicaThunb，twelve entomopathogenic fungi strains were isolated by culturing spores washing from dead larvae，these fungi were identified with morphological characteristic and rDNA ITS sequence.Results：All strains of fungi were identified asNomurearileyi.Conclusion：Nomurearileyiis one kind of entomopathogenic fungus that could kill some kind of lepidoptera larvae on the medicinal plant ofLonicerajaponicaThunb，it will be useful research materials for study to control insects ofLonicerajaponicaThunb and other medicinal plants.

LonicerajaponicaThunb；Heterolochajinyinhuaphaga；Helicoverpaarmigera；Nomurearileyi

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.013

2015-02-25)

国家自然科学基金(81102745)；北京市农业局项目(PXM2014-036203-000007)

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陈君，研究员，研究方向：药用植物栽培与保护；Tel：(010)57833352，E-mail：junzichen@263.net