肿瘤转移抑制基因-1在前列腺癌组织中的表达及其意义*

孙 翔 罗龙华 冯 亮

南昌大学第一附属医院泌尿外科（江西南昌 330006）

肿瘤转移抑制基因-1在前列腺癌组织中的表达及其意义*

孙 翔 罗龙华 冯 亮

南昌大学第一附属医院泌尿外科（江西南昌 330006）

目的 分析肿瘤转移抑制基因-1（TMSG-1）在前列腺癌细胞株中与前列腺癌组织中的表达及其临床意义。方法 PCR法检测TMSG-1在人不同转移潜能前列腺癌细胞株低转移潜能（PC-3M-284）和高转移潜能（PC-3M-IE8）中的表达，Matrigel穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力，采用免疫组织化学方法检测TMSG-1在人前列腺增生及前列腺癌组织中的表达。结果 两种不同转移潜能前列腺癌细胞株中TMSG-1 mRNA的相对表达量之间差异有统计学意义（P＜0.05）。TMSG-1在低转移潜能（PC-3M-2B4）细胞株的mRNA（2.8±0.3）明显高于高转移潜能细胞株PG-IE8的表达（1.2±0.2）。免疫组化检测TMSG-1在前列腺增生阳性表达高于前列腺癌表达，差异显著；Matrigel穿膜侵袭实验结果显示，3个正义转染组的穿膜细胞明显减少，穿膜细胞数分别为42.31±3.16、52.00±1.83和23.93±2.79，与空白对照组（82.01±3.14）和空载体对照组（78.00±3.02）相比，均明显减少，差异具统计学意义（P＜0.05）。结论 TMSG-1具有抑制前列腺癌细胞生长、促进其凋亡、抑制其侵袭能力等重要功能，TMSG-1的表达与肿瘤细胞转移潜能呈负相关。

基因, 肿瘤抑制; 前列腺肿瘤；细胞系, 肿瘤; 肿瘤转移

肿瘤转移抑制基因是近年研究的一大热点，其表达高低与某些肿瘤的转移密切相关。从1988年发现首个肿瘤转移抑制基因NM23至今[1]，共有数十个基因被研究并确定为肿瘤转移抑制基因。其调节癌细胞的生长信号及肿瘤细胞的生物学行为、抑制肿瘤细胞的趋化性和侵袭性、限制肿瘤细胞迁徙的机制逐渐明确，在临床实践中的价值也越来越受到重视。前列腺癌是威胁老年男性的主要恶性肿瘤[2]。我国前列腺癌的发病率虽明显低于欧美国家， 但随着人均寿命延长、膳食结构改变和诊断技术提高[3]， 发病率呈明显升高趋势， 在男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中发病率跃居第3位。我们采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）及细胞爬片免疫荧光组织化学方法，检测人不同转移潜能前列腺癌细胞株中TMSG-1在mRNA水平和蛋白质水平上的表达差异，证实了TMSG-1在抑制肿瘤转移过程中的作用。我们采用免疫组化法检测了50例前列腺癌标本中TMSG-1的表达，探讨其在前列腺癌生长、发生转移中的作用意义。

材料与方法

一、一般资料

人前列腺癌细胞株PC-3M-2B4和PC-3M-IE8由北京大学医学部病理系癌生物学研究室提供。TMSG-1全长真核表达载体pcDNA3.0.TMSG-1-FLAG由本室构建并保存。Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品，G418、二苯基溴化四氮唑蓝（MrIYI’）和小鼠抗FLAG标签单克隆抗体为Sigma公司产品，小鼠抗人B-Tubulin单克隆抗体为Neomarker公司产品，低熔点琼脂糖为Bethesda Research Laboratories公司产品，Matrigel为BD公司产品，碳酸酯微孔滤膜为Millipore公司产品。

二、方法

实时荧光定量PCR方法检测不同转移潜能前列腺癌细胞株中mRNA的相对表达量：细胞总RNA提取严格按照Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行，所得RNA进行浓度、纯度及完整性的检测，按RT试剂说明进行RT反应，实时荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃ 3 min，95℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30 s 共进行40个循环，GADPH作为内参考。

（一）活细胞计数

取对数生长期的细胞，以每孔1.0×104个细胞的密度接种于24孔板，3个正义转染组（IE8-S1、IE8-S2、IE8-S3）、空白对照组和空载体转染组每组每天设3个平行孔。自次日起每组每天消化3个平行孔，进行活细胞计数，取平均值。连续检测7 d，绘制细胞生长曲线。

（二）采用免疫组化法检测前列腺癌组织中TMSG-1的表达

严格按照PV-9000免疫组织化学试剂盒来检测40例前列腺增生组织及60例前列腺癌组织中TMSG-1的表达，判定标准为：光镜下以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性染色，由两名病理医师分别在高倍镜下随机选择5个视野，计数。结合阳性细胞染色强弱及阳性细胞百分比两个方面计算TMSG-1的免疫组织化学染色评分。

三、统计学处理

采用SPSS15.0 统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，当 P＜0.05 时为差异具有统计学意义。

结 果

一、实时荧光定量PCR方法检测不同转移潜能前列腺癌细胞株中mRNA的相对表达量

提取的RNA无降解。TMSG-1主要定位于胞质中，靠近细胞膜处阳性信号普遍增强。两种肿瘤细胞株内都能检测到TMSG-1蛋白，前列腺癌细胞株中TMSG-1实时荧光定量PCR产物约134bp。两种不同转移潜能前列腺癌细胞株中TMSG-1 mRNA的相对表达量之间差异有统计学意义（P＜0.05）。TMSG-1在低转移潜能（PC-3M-2B4）细胞株的mRNA（2.8±0.3）明显高于高转移潜能细胞株PG-IE8的表达（1.2±0.2），差异具统计学意义（P＜0.05）。

二、RT-PCR检测

结果显示，所选取的3个正义转染克隆（PC-3M-1E8 s1、s2、s3）均有TMSGl-FLAG融合基因的mRNA转录（图1）。

图1 RT-PCR检测结果

三、免疫组化检测

免疫组化检测TMSG-1在前列腺增生阳性表达高于前列腺癌表达，差异显著，P＜0.05，TMSG-1在前列腺组织的表达见图2A，TMSG-1在前列腺增生组织中的表达见图2B。

四、TMSG-1表达上调对PC-3M-1 E8细胞体外侵袭能力的影响

Matrigel穿膜侵袭实验结果显示，3个正义转染组的穿膜细胞明显减少（图3），穿膜细胞数分别为42.31±3.16、52.00±1.83和23.93±2.79，与空白对照组（82.01±3.14）和空载体对照组（78.00±3.02）相比，均明显减少（P＜0.05），差异具统计学意义。

图2 TMSG-1在前列腺（A）及前列腺增生组织（B）中的表达（×200）

图3 表示Matrigel穿膜侵袭试验显示3个正义转染组的穿膜细胞明显减少（HE染色×100）

讨 论

前列腺癌在美国位于男性恶性肿瘤的发病率第1位，死亡率第2位[4]。近20年来，随着我国人均寿命的延长、膳食结构的改变和诊断技术的提高，前列腺癌的发病率明显升高，在男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中发病率跃居第3位[5]。肿瘤转移是恶性肿瘤最严重的后果，对肿瘤转移相关基因尤其是肿瘤转移抑制基因的研究，一直是肿瘤研究领域的热点。目前已经发现多个肿瘤转移抑制基因，并对其功能展开研究，如NM23、MKK4、KAll、BRMSl和KISSI等。TMSG-1又名LASS2（LAGI longevity assurance homolog 2），是一个编码380个氨基酸的跨膜蛋白，含有10个外显子，相对分子质量为45000，定位于人染色体1q21.2上[6]。

苏静等[7]将TMSG-1真核表达载体转染筛选出 3个TMSG-1高表达稳定转染细胞株，研究结果发现TMSG-1的表达上调可降低前列腺癌细胞体外增殖能力。国外近年的研究表明[8]，包括TMSG-1在内的LASS家族各成员，均可使细胞内神经酰胺水平明显升高。神经酰胺是神经鞘脂代谢中的重要脂质分子，在对多种肿瘤的研究中发现，神经酰胺可抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡，具有肿瘤抑制作用[9]。通过实时荧光定量PCR技术检测显示，在低转移潜能前列腺癌细胞株PC-3M-2B4中的TMSG-1 mRNA表达量明显高于在高转移潜能前列腺癌细胞株PC-3MIE8中的表达，两者之间差异有统计学意义。这说明TMSG-1基因参与了肿瘤的转移，并呈现明显负相关。另外免疫荧光、定量比较分析两种不同转移潜能前列腺癌细胞株中TMSG-1的表达发现，TMSG-1主要定位于胞质中，靠近细胞膜处阳性信号普遍增强。两种肿瘤细胞株内都能检测到TMSG-1蛋白，但其表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）。对比两种不同转移潜能的前列腺癌细胞株，TMSG-1蛋白在PC-3M-21M细胞中的表达明显高于在PC-3M-IE8细胞株中的表达。故TMSG-1同肿瘤的转移能力呈现负相关，是一种肿瘤转移抑制基因，可在抑制肿瘤侵袭及转移过程中发挥重要作用。

苏静等[10]曾经对肺巨细胞癌细胞系PG-BEl的研究表明，TMSG-1具有抑制其生长、促进其凋亡、抑制其侵袭能力等重要功能，TMSG-1的表达与肿瘤细胞转移潜能呈负相关。同本文前列腺癌细胞系研究结果一致说明了TMSG-1是可以通过抑制肿瘤增殖能力而影响前列腺癌细胞转移过程。无论从体内实验还是体外实验均证实了TMSG-1在抑制肿瘤侵袭及转移过程中发挥的重要作用。但TMSG-1是否可在其他肿瘤转移过程中发挥作用及作用机制还需要更进一步讨论。

1 裴斐, 由江峰, 宁钧宇, 等. 人肿瘤转移抑制基因TMSG-1单克隆抗体的制备、鉴定及在肿瘤检测中的应用. 中华病理学杂志 2005; 34(1): 15-21

2 郝玉美, 刘谦, 宋娜玲.前列腺癌干细胞相关肿瘤标志物的研究进展. 中国肿瘤临床 2013; 40(19): 1199-1202

3 徐晓艳, 裴斐, 由江峰, 等. 一种新的肿瘤转移抑制基因TMSG-1的研究现状. 癌症 2010; 29(7): 697-702

4 谢立平, 王潇. 高危前列腺癌的治疗. 中华泌尿外科杂志2012; 33(5): 325-328

5 程亮, 滕晓东, 周杰. 多灶性前列腺癌分子病理及临床应用. 中华病理学杂志 2011; 40(7): 436-439

6 徐晓艳, 由江峰, 裴斐, 等. 前列腺癌细胞系中TMSG-1的表达及其意义. 临床与实验病理学杂志 2011; 27(1): 40-43

7 苏静, 由江峰, 王洁良, 等. 人肿瘤转移抑制基因1转染对人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生物学行为的影响.中华病理学杂志 2007; 36(10): 672-676

8 金道忠, 朱兴族. 神经酰胺代谢及凋亡信号调节. 生命科学 2006; 18(5): 481-486

9 张秋月, 费素娟. 神经鞘磷脂在肿瘤耐药逆转中的作用研究进展. 徐州医学院学报 2010; 30(8): 558-560

10 苏静, 由江峰, 王洁良, 等. 肿瘤转移抑制基因1抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭能力. 中华肿瘤杂志 2008; 30(6): 404-407

（2014-12-10收稿）

Expression of TMSG-1 in prostate cancer and its clinical signifcance

Sun Xiang, Luo Longhua, Feng Liang
Department of Medical Oncology, the First Affliated Hospitial of Nanchang Univerity, Nanchang 330006, Jiangxi, China

Objective To analyze the expression of TMSG-1 in prostate cancer cells and prostate cancer tissues, and explore its clinical significance. Methods The expression of TMSG-1 in PC-3M-284 cells and PC-3M-IE8 cells was detected by PCR. Invasive ability of cancer cells were evaluated by cell invasion assay. The expression of TMSG-1 in human prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma tissues were measured by immunohistochemical analysis. Results There was a signifcant difference in the expression of TMSG-1 between two prostate cancer cells with different metastatic potential(P＜0.05). The expression of TMSG-1 in PC-3M-2B4 cells was signifcantly higher than that in PGIE8 cells. Immunohistochemical analysis showed that TMSG-1 expression in benign prostate hyperplasia tissues was obviously higher than that in prostate cancer. Cell invasion assay demonstrated that the number of invaded cells in three trnsfected groups(42.31±3.16, 52±1.83 and 23.93±2.79) was signifcant lower than that of the control group (82.01±3.14) and empty vector group (78.00±3.02)(P＜0.05). Conclusion TMSG-1 inhibits the growth of prostate cancer cells, induces apoptosis, and decreases the invasion ability. The expression of TMSG-1 is negatively associated with metastasis potential of tumor cells.

genes, tumor suppressor; prostatic neoplasms; cell Line, tumor; neoplasm metastasis

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.06.004

R 737.25

资助: 江西省卫生厅课题（项目编号：2005-1048）