中草药复合益生菌制剂对凡纳滨对虾生长、抗病力及水质的影响

汤菊芬，黄　瑜，蔡　佳，鲁义善，吴灶和，简纪常

（1. 广东海洋大学水产学院，广东　湛江 524088；2. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东　湛江　524088）

中草药复合益生菌制剂对凡纳滨对虾生长、抗病力及水质的影响

汤菊芬1,2，黄瑜1,2，蔡佳1,2，鲁义善1,2，吴灶和2，简纪常1,2

（1. 广东海洋大学水产学院，广东湛江 524088；2. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江524088）

将枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等比例混合，制成芽孢杆菌制剂；将芽孢杆菌制剂与粪肠球菌、嗜酸乳杆菌等比例混合制成复合益生菌制剂；将分别用3种芽孢杆菌发酵的中草药等比例混合制成中草药芽孢杆菌制剂；将分别用5种益生菌发酵的中草药等比例混合，制成中草药复合益生菌制剂。在饲料中分别添加4种益生菌制剂（活菌为2×107cfu/g），研究 4 种制剂对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）生长、抗病力及水质的影响。结果表明：1）4种益生菌制剂均可提高凡纳滨对虾的成活率、增重率和饲料利用率（P < 0.05），中草药益生菌制剂组的促生长效果优于益生菌制剂组，以中草药复合益生菌制剂组促生长效果为最佳（P < 0.05）；2）4种益生菌制剂均可维持对虾养殖水体 pH 值、氨态氮和亚硝酸盐含量的稳定（P < 0.05），中草药益生菌制剂对水质的改良效果优于益生菌制剂（P < 0.05）；3）用 1×108cfu/mL 的哈维氏弧菌（Vibro harveyi）菌液浴浸泡凡纳滨对虾 10 d，凡纳滨对虾的累计死亡率由大到小依次为中草药复合益生菌制剂组（31.11%）、复合益生菌制剂组（35.56%）、中草药芽孢杆菌制剂组（37.78%）、芽孢杆菌制剂组（44.44%）、对照组（93.33%）。在饲料中添加一定比例的中草药复合益生菌制剂可提高凡纳滨对虾的生长指标、改善养殖水体环境、提高对虾的抗病力。

凡纳滨对虾；饲料添加剂；益生菌制剂；中草药；复合制剂；生长；水质；抗病力

近年来，随着对虾集约化养殖的迅猛发展，水环境恶化，病害频发，抗生素及其他药物的使用已产生细菌抗药性及药物残留等问题，严重影响了对虾产业的健康持续发展[1-2]。为此，寻找无公害药物替代品成为研究热点。中草药和益生菌因具有促进养殖动物生长、增强机体免疫功能及抗病力等功效，广泛应用于水产养殖业[3-4]。研究表明，中草药和益生菌共同使用具有协同增效作用，中草药可促进益生菌增殖，益生菌可促进生物体对中草药的吸收和利用[5]。有关中草药和益生菌联合使用在畜禽上的研究较多，在水产方面的研究仅见在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）[6-9]、罗非鱼（Oreochromis niloticus）[10]和建鲤（Cyprinus carpio）[11]方面的报道，但这些研究均为同时在饲料中添加益生菌和中草药，而用益生菌发酵中草药，制备中草药复合益生菌制剂，研究添加该制剂的对虾饲料养殖效果方面尚未见报道。本研究在凡纳滨对虾饲料中添加一定比例的中草药复合益生菌制剂，研究中草药复合益生菌制剂对凡纳滨对虾生长、抗病力及养殖水质的影响，为中草药复合益生菌制剂在对虾养殖业中的推广应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

试验用凡纳滨对虾，同批次，同龄，同规格，体质量（5.82±0.4）g，由湛江市东海岛民安镇大熟村林老板对虾养殖池塘提供，挑选健康、规格均一的对虾暂养7 d后用于试验，暂养条件：温度（28.5 ±2）℃，盐度为5，过滤、消毒海水。

复方中草药制剂由金银花、板蓝根、杜仲、五味子、黄芪、山楂、生姜、金银花、连翘、柴胡、甘草组成，粉碎，过孔径180 μm筛，按一定比例混匀。

菌株纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）由广东绿百多生物科技有限公司提供。

基础饲料，某品牌的凡纳滨对虾 2 号料，购于东海岛东简镇的某饲料经销店，营养指标（质量分数）：水分10.53%，粗蛋白42.08%，粗脂肪9.33%，粗灰分0.95%，粗纤维2.66%。

1.24种益生菌制剂的制备

1.2.1芽孢杆菌制剂及复合益生菌制剂的制备菌种活化：取纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌种，分别以体积分数1% 接种于营养肉汤中，于摇床中，在37 ℃、200 r/min的条件下培养24 h，再二次活化12 h后备用。嗜酸乳杆菌、粪肠球菌分别接入乳酸细菌（MRS）液体培养基中，于37 ℃、厌氧条件下培养48 h，再二次活化24 h后备用。

芽孢杆菌制剂由上述3株芽孢杆菌等比例组成，复合益生菌制剂是由芽孢杆菌制剂、粪肠球菌和嗜酸乳杆菌等比例混合而成，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2中草药芽孢杆菌制剂及中草药复合益生菌制剂的制备参照郭文婷等[12]方法，将复方中草药制成生药质量浓度为1 g/mL 的提取液，再按表 1比例，在 5 种益生菌的培养基中分别加入中草药提取液，然后再分别接种体积分数1%的5 种已活化益生菌，制得 5 种中草药益生菌。中草药芽孢杆菌制剂由 3 种中草药芽孢杆菌等比例混合而成，中草药复合益生菌制剂由5种中草药益生菌等比例混合而成。

表1　5种益生菌制剂培养方法Table 1　Cultivation method of five probiotics

1.3试验饲料制备

试验饲料按表 2 制备。

1.4试验设计

将凡纳滨对虾随机分成5个处理，每个处理3个重复组。标记为A、B、C、D、E组（表2），按表2所示分别饲喂基础饲料和试验饲料。

1.5饲养管理方法

养殖试验在广东海洋大学东海岛高新科技园室内养殖车间的 15 只装水0.5 m3的玻璃钢桶中进行，周期为 30 d。每个玻璃钢桶放养对虾30 尾，依照1.4 的方案按体质量的8% ～ 10%投喂相应饲料，投饲时间分别为 6:00、10:00、19:00 和 23:00，早晚的投喂量占日投喂量的 60%～70%。每周根据对虾的生长状况调节投饲量。试验期间不间断充气，不换水，每天清理粪便。水温为 (28.5±2) ℃。

表2　试验饲料Table 2　Preparation of experiment feed

1.6生长及水质指标测定

检测实验开始时养殖水体的pH值、氨态氮和亚硝酸盐含量，然后每3 d在17：00取水样测定水体的pH值、氨态氮和亚硝酸盐含量。养殖试验结束时，停食24 h，各组对虾称质量，计数。

增重率 =（终末体质量 - 初始体质量 / 初始体质量）×100 %，

成活率 = 终末对虾数 / 初始对虾数×100 %，

饵料系数 = 摄食量 / (终末体质量 + 死亡个体质量 - 初始体质量)。

氨态氮用纳氏比色法测定，亚硝酸盐用萘乙二胺分光光度法检测，pH值用玻璃电极法检测。

1.7攻毒试验

参照朱学芝等[13]方法，在养殖试验结束后，每组随机抽取对虾45 尾，用含哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）的水浸泡凡纳滨对虾，水体中的哈维氏弧菌维持在1×108cfu/mL，观察 10 d内的对虾死亡情况，统计死亡率。试验期间停饲。

1.8数据处理

采用Excel 和SPSS11.5 软件对数据进行统计分析，先对数据作单因素方差分析（ANOVA），对有显著差异者作Duncan’s 多重比较，所有数值用平均值±标准误表示。

2　结 果

2.1中草药益生菌制剂对凡纳滨对虾生长性能指标的影响

中草药益生菌制剂对凡纳滨对虾生长性能指标的影响见表3。B、C、D、E 组凡纳滨对虾的成活率和增重率均高于A组，饵料系数低于A组，差异有统计学意义（P < 0.05），且C组和E组对凡纳滨对虾生长性能指标的影响效果分别优于B组和D组，说明饲料中添加益生菌制剂、中草药益生菌制剂均可以显著促进凡纳滨对虾生长，中草药益生菌制剂的促生长效果优于益生菌制剂，以添加中草药复合益生菌制剂的促生长效果为最佳。

2.2中草药益生菌制剂对养殖水体 pH值的影响

图1可见，对照组和实验组pH值均从9 d开始呈下降趋势。尤其是在养殖后期，由于积累有机物的发酵分解，A组pH值的下降较其他组快（P < 0.05），4个实验组pH变化差异无统计学意义（P > 0.05），说明饲料添加益生菌制剂、中草药益生菌制剂均可维持水体pH相对稳定，有利于凡纳滨对虾生长。

表3　中草药益生菌制剂对凡纳滨对虾生长及饲料利用率的影响Table 3　Effects of probiotics combined with Chinese herbal medicine on growth and feed utilization of of Litopenaeus vannamei

图 1　pH值的变化情况Fig. 1　pH change in experimental water

2.3中草药益生菌制剂对养殖水体亚硝酸盐的影响

中草药益生菌制剂对养殖水体亚硝酸盐含量的影响见图2。图2可见，5组的亚硝酸盐含量在实验初期均上升较慢，随着实验的进行，对照组亚硝酸盐含量9 d时开始迅速增加，其他4组均于15 d时方缓慢增加，且4个实验组亚硝酸盐含量均低于同期对照组（P < 0.05），但4个实验组之间亚硝酸盐含量差异无统计学意义（P > 0.05）。说明在饲料中添加益生菌制剂、中草药益生菌制剂均可降低养殖水体亚硝酸盐的含量。

图 2　亚硝酸的变化情况Fig. 2　Change of nitrite content in experimental water

2.4中草药益生菌制剂对养殖水体氨态氮的影响

中草药益生菌制剂对养殖水体氨态氮含量的影响见图3。图3可见，实验初期（前3 d），各组间氨态氮含量差异无统计学意义（P > 0.05），但从6 d时开始，4个实验组氨态氮含量均低于同期对照组（P < 0.05），中草药复合益生菌制剂组对养殖水体的氨态氮降解效果优于益生菌制剂组（P < 0.05）。

图3　氨态氮的变化情况Fig. 3 Ammonia change in experimental water

2.5中草药益生菌制剂对凡纳滨对虾抗病力的影响

中草药益生菌制剂对凡纳滨对虾抗病力的影响见图4。图4表明，经人工感染哈维氏弧菌后，凡纳滨对虾的累计死亡率E组（31.11%）< D组（35.56%）< C组（37.78%） < B组（44.44%） < 对照组（93.33%），说明在饲料中添加益生菌制剂、中草药益生菌制剂均可提高凡纳滨对虾抗哈维氏弧菌感染的能力，对虾抗病力以中草药复合益生菌制剂组效果最佳。

图4　中草药益生菌制剂对凡纳滨对虾抗病力率的影响Fig. 4　Effect of probiotics combined with Chinese herbal medicine on survival rate of Litopenaeus vannamei

3　讨 论

3.1中草药益生菌制剂对凡纳滨对虾生长性能的影响

益生菌可产生维生素、氨基酸、促生长因子、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等多种酶，促进水产动物的生长[14-15]。李晓英等[16]在饲料中添加复合芽孢杆菌时发现，实验组中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）的平均生长速度为0.15 g/d，显著高于对照组（0.12 g/d）；朱学芝等[17]将乳酸杆菌（Lactobacillus sporogenes）、地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌（等比例）、复合菌虾乐333添加于饲料中或投入养殖水体中，结果发现，三者均可促进凡纳滨对虾的生长，降低饲料系数。胡毅等[18]研究饲料中添加单一益生菌和复合益生菌，结果表明，复合益生菌饲喂组凡纳滨对虾的特定生长率高于对照组 (P < 0.05)，而单一益生菌饲喂组与对照组差异无统计学意义(P > 0.05)。于明超等[7]研究表明，饲料中添加中草药和芽孢杆菌促进了凡纳滨对虾的生长，且共同添加的效果优于单独添加。本研究结果与上述研究结果相一致，证明饲料中添加芽孢杆菌制剂、中草药芽孢杆菌制剂、复合益生菌制剂、中草药复合益生菌制剂均可促进凡纳滨对虾的生长（P < 0.05），中草药益生菌制剂组的促生长效果优于益生菌制剂组，以中草药复合益生菌制剂的促生长效果最佳。这可能是因为中草药和益生菌具有协同增效作用。一方面，中草药富含多种营养物和一些未知的诱食因子，可以增强养殖动物的食欲，促进水产动物机体代谢和消化酶的分泌，提高营养物质利用率，从而加速养殖动物生长发育，降低饲料系数[19]；另一方面，益生菌制剂中的芽孢杆菌和乳酸杆菌可产生多种消化酶类[11]，可提高动物消化道内消化酶的生物活性，促使动物机体更好地消化和吸收胃肠道中的营养物质，提高饲料利用率。此外，乳酸杆菌还可分解转化饲料中一些机体难以吸收的有机物质，将一些糖类发酵成乳酸，降低动物肠道中的pH 值而形成酸性环境，有利于动物机体对钙、铁等矿物质和维生素的吸收和利用，从而促进凡纳滨对虾的生长。

此外，本研究中对照组和试验组的对虾增重率均高于文献[7, 17-18]结果，可能与本研究的凡纳滨对虾正好处于生长速度较快的中后期阶段，以及与对虾饲料不同有关。

3.2中草药益生菌制剂对水质因子的影响

在集约化水产养殖中，残饵及水产动物的排泄物等是水体污染的主要来源[20]。益生菌制剂可降解水体中有机质，一定程度上调节水质，由于各细菌种属能量代谢的途径和方式也不同，因此对环境中不同种类有机质的降解能力也存在一定差异[21]。朱学芝等[17]在饲料中添加乳酸杆菌、复合芽孢杆菌、复合菌虾乐等益生菌制剂，实验组水体中的 pH值、氨态氮和亚硝酸盐含量均低于对照组；而汤保贵等[10]研究表明，饲料中添加益生菌制剂和中草药联合制剂可明显降低罗非鱼（Oreochro is niloticus）养殖水体中的亚硝酸盐，但对氨氮无降低作用。本研究表明，饲料中添加益生菌制剂、中草药益生菌制剂均可稳定养殖水体的氨态氮、亚硝酸盐和pH 值，与朱学芝等[17]的结果一致，而与汤保贵等[10]的结果略有差异。这可能是因为未定植对虾肠道而随粪便排入水体的益生菌，以及随残饵释放入水体的益生菌在适宜环境下生长增殖，从而发挥水质调节作用；试验对象、所用益生菌菌种、中草药益生菌制剂的制备和使用方法等的不同可能导致与汤保贵等[10]的结果略有差异。

3.3中草药益生菌制剂对凡纳滨对虾抗病力的影响

益生菌制剂通过分泌抑菌物质与病原菌争夺营养或附着位点而抑制其生长，改善机体免疫功能等[22]。朱学芝等[13]研究表明，饲料中添加芽孢杆菌可提高凡纳滨对虾血细胞总量以及血清酚氧化酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶含量（P < 0.05），降低血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量（P < 0.05），提高对虾抗溶藻弧菌感染的能力。据胡毅等[18]报道，饲料中添加益生菌可降低凡纳滨对虾肠道及粪便的弧菌数（P < 0.05），提高对虾血清蛋白浓度、酚氧化酶活力、溶菌酶活力和总抗氧化力。文国樑[6]研究了饲料中添加芽孢杆菌和中草药制剂对凡纳滨对虾免疫功能的影响，发现芽孢杆菌和中草药制剂对凡纳滨对虾的免疫指标（血细胞数量、酚氧化酶、活菌酶等) 产生积极影响，并有一定的协同作用。本研究结果与朱学芝[17]、胡毅[18]、文国樑等[6]的研究结果相一致，经人工感染哈维氏弧菌后，4个实验组对虾的存活率高于实验组（P < 0.05），复合益生菌制剂组的存活率高于芽孢杆菌制剂组，中草药复合益生菌制剂组的抗病效果优于中草药芽孢杆菌制剂组，以中草药复合益生菌制剂组对虾抗病力最强。这可能与中草药与益生菌产生协同增效作用有关。一方面，中草药在体外经益生菌发酵、分解后产生了有机酸、生物碱等抑菌物质，这些抑菌物质进入对虾肠道后可抑制有害致病菌的生长繁殖；中草药中所含黄酮、皂甙、核苷酸、维生素、叶酸、多糖等活性成分本身就是益生菌的重要生长因子[23]，进入对虾肠道后，可促进益生菌的增殖并分泌抑菌物质；各种益生菌在肠道中的生长增殖势必会与肠道中有害病原菌抢夺营养物质和附着位点，从而抑制了病原菌的生长繁殖，增强对虾的抗病能力。此外，芽孢杆菌在肠道中的生长繁殖，会消耗掉肠道中氧气，为肠道乳酸杆菌（Lactobacillue）、双歧杆菌（Bifidobacterium）等厌氧细菌的繁殖创造厌氧环境条件，同时也抑制了好氧病原菌的生长繁殖，这可能是复合益生菌比单一益生菌具有更好抗病效果的原因。复合益生菌制剂组对虾的存活率高于中草药芽孢杆菌制剂组，可能与不同细菌在肠道微生物区系中占有的生态位不同有关。

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（责任编辑：刘庆颖）

Effects of a Probiotics Combined with Chinese Herbal Medicine on Growth Performance, Water Quality and Resistance to Diseases for Litopenaeus vannamei

TANG Ju-fen1,2, HUANG Yu1,2, CAI Jia1,2, LU Yi-shan1,2, WU Zao-he2, JIAN Ji-chang1,2
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. Guangdong Province Key Laboratory of Pathogen Biology and Epidemiology of Aquatic Economic Animals, Zhanjiang 524088, China）

The effects of a probiotics combined with Chinese Herbal Medicine on growth performance, water quality and resistance to diseases of Litopenaeus vannamei were studied by adding four different probiotics (2×107cfu/g), compound Bacillus (mixed Bacillus subtilis, Bacillus natto and Baclicus lincheniformis with equal parts), Chinese herbal medicine compound Bacillus, compound Probiotics (mixed Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus and compound Bacillus with equal parts), Chinese herbal medicine compound probiotics,respectively to the feed. The results indicated that: (1) Four probiotics had significant effects on survival rate, weight-gaining and feed conversion ratio (P<0.05), and Chinese herbal medicine probiotics group on the growth promoting effect is better than that of probiotics group, that of Chinese herbal medicine compound probiotics group to the best (P<0.05). (2) Four probiotics can maintain the stable of pH, ammonia nitrogen and nitrite of aquaculture water (P<0.05), The effects of Chinese herbal medicine probiotics on the improvement of water quality is better than that of probiotics（P<0.05）；(3) After water bath soak Litopenaeus vannamei with containing 1×108cfu/mL of Vibro harveyi for 10 d, the cumulative mortality rate of Litopenaeus vannamei respectively are Chinese herbal medicine compound probiotics (31.11%), compound Brobiotics (35.56%), Chinese herbal medicine compound Bacillus (37.78%), compound Bacillus (44.44%), control group (93.33%). Results showed that by adding a certain proportion of Chinese herbal medicine compound probiotics, the growth index of Litopenaeus vannamei can be enhanced, the quality of aquaculture water and capacity of disease resistance can be improved.

Litopenaeus vannamei; feed additive; probiotics; compound preparation; Chinese Herbal Medicine; growth; disease resistance; aquaculture water quality

S963.73+6

A

1673-9159（2015）06-0047-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2015.06.009

2015-06-30

广东省科技计划项目（2015A020209181）；湛江市科技计划项目 (2012A0302）

汤菊芬（1964－），女，硕士，高级工程师，主要从事水产动物营养与免疫研究。E- mail: tjf10002000@163.com

简纪常，男，教授，主要从事水产动物免疫及疾病控制。E-mail：jianjc@gmail.com