骨软骨栓液相线跟踪法处理方案研究

虞效益 张绍志 陈光明,*

1(浙江大学宁波理工学院，浙江 宁波 315100)2(浙江大学制冷与低温研究所，杭州 310027)

骨软骨栓液相线跟踪法处理方案研究

虞效益1张绍志2陈光明1,2*

1(浙江大学宁波理工学院，浙江 宁波 315100)2(浙江大学制冷与低温研究所，杭州 310027)

关节软骨的长期保存是临床上软骨移植得以广泛开展的技术保证。液相线跟踪法作为一种新型的玻璃化保存方法，是一种很有价值的关节软骨低温保存技术。本研究从数值分析的角度指出了应用现有液相线跟踪法方案处理骨软骨栓存在的不足，并以避免软骨细胞在处理过程中遭受冰晶损伤为目标，提出了软骨直径6 mm、厚1 mm的骨软骨栓的液相线跟踪法处理方案，方案共13步，包括降温提高浓度、升温降低浓度两个过程，共计耗时1012 min。为减少处理时间，采取尽可能降低载入浓度、强化传质过程等措施显得十分有必要。

关节软骨；玻璃化保存；液相线跟踪法；传质；数学建模

引言

软骨移植是临床上修复、重建和替换受损关节软骨的有效手段，捐献的软骨若能长期保存，那么外科医生将可针对病变部位挑选合适的移植物，并且有充裕的时间进行多项检测，以防止供者可能带来的病毒或细菌感染，这不仅有助于提高软骨移植手术的成功率，而且使得软骨移植手术的广泛开展成为可能[1, 2]。玻璃化保存是一种很有希望实现关节软骨长期保存的技术，到目前为止，关节软骨玻璃化保存的研究虽已取得了相当的研究成果[3-5]，特别是近来Jomha等报道他们玻璃化保存人关节软骨获得了75%的软骨细胞存活率[6]，但要真正应用于临床移植，细胞存活率仍有待进一步提高。玻璃化法实施的难点是如何把高浓度的低温保护剂载入生物材料，以及突破样品实际降温和升温速率的制约。Pegg等利用低温保护剂毒性随温度降低而降低的特点，提出一边降低温度一边将二甲亚砜载入关节软骨，并始终使温度略高于组织冻结点的方法，最终使关节软骨内二甲亚砜达到近60%(w/w)的高浓度，如此高浓度的二甲亚砜也使得实现玻璃化和避免反玻璃化与所需降温和升温速率无关。他们用此玻璃化法保存羊关节软骨获得了很大成功，并将其命名为“Liquidus-tracking method (LTM)”[7]，文中将其译成“液相线跟踪法(LTM)”。

Pegg等的LTM方案是针对特定尺寸(直径6 mm、厚约1 mm)的不带有软骨下骨(subchondral bone)的羊关节软骨片而提出的，而临床上软骨移植物的一般形式为带有软骨下骨的骨软骨栓(osteochondral dowels)。Pegg等的方案是否适用于骨软骨栓有待验证。本文采用数值分析的方法，先对现有的LTM方案用于处理骨软骨栓的可行性进行分析，然后以防止软骨组织内冰晶形成为目的，提出特定尺寸的骨软骨栓的LTM处理方案。

1 二甲亚砜渗透关节软骨数学模型

二甲亚砜处理(加入/取出)关节软骨的过程主要为一扩散传质过程，笔者之前已建立了描述二甲亚砜渗透关节软骨的数学模型[8]，此处只对模型作简要描述。

假设：1)关节软骨不产生也不消耗二甲亚砜，不存在通过对流方式传递的二甲亚砜，不存在温度和压力梯度；2)在处理过程中关节软骨不发生变形；3)关节软骨为一多孔介质；4)二甲亚砜在关节软骨中的扩散是各向同性的；5)二甲亚砜在关节软骨中扩散的温度、浓度依赖性和非理想性与在单纯溶液中的相同；6)忽略载入软骨细胞中的二甲亚砜的量；7)处理溶液是由二甲亚砜和水组成的二元溶液；8)将骨软骨栓样品看成是圆柱体，二甲亚砜无法从骨侧渗入/渗出软骨。

根据上述假设，二甲亚砜在关节软骨中的扩散采用下述连续性方程来描述：

(1)

(2)

式中，Ddw为二甲亚砜在水中的扩散系数，H为新鲜软骨含水量，λ为软骨曲折度因子。对于二元溶液中的扩散，溶质在溶剂中的扩散系数等于溶剂在溶质中的扩散系数，于是有：

Ddw=Dwd

(3)

式中，Dwd为水在二甲亚砜中的扩散系数。另外，对于二元溶液，各组分的互扩散系数与溶剂(本文指水)的自扩散系数存在如下关系：

(4)

式中，Dw为水在二甲亚砜水溶液中的自扩散系数，φw为水的体积分数，μw为水的化学势，R为通用气体常数，T为温度。

式(4)中的Dw可通过自由体积模型计算，即

(5)

(6)

(7)

(8)

式中，Mw和Md分别为水和二甲亚砜的相对分子质量。Dw,0与浓度有关，采用如下所示的二次多项式表达：

(9)

式中，a、b和c为常数。而式(4)中的[△μw/(RT)]T,P项可根据Flory-Huggins热力学理论计算，即：

φw)+

χ(1-φw)2

(10)

(11)

式中，y为相对分子体积，为Flory-Huggins相互作用参数，和分别为二甲亚砜和水的比体积。

图1 骨软骨栓示意图Fig.1 The schematic diagram of osteochondral dowel

骨软骨栓样品为圆柱形，软骨下骨上方附着直径D=6 mm、厚H=1 mm的软骨组织(见图1)，且软骨组织为各向同性、均匀一致的材料，故计算区域取图1中矩形abcd即可。对于初始条件，假设新鲜骨软骨栓中不含二甲亚砜：

wd(z，r，t=0)=0

(12)

式中，z和r分别为轴向坐标和径向坐标。对于边界条件，假设二甲亚砜只可从顶面和侧面渗入软骨组织，而无法从底面(即骨侧)渗入，顶面与侧面的表面浓度等于周围处理溶液浓度(ws)的0.9倍[9]：

(13)

wd(z=H,r,t)=0.9ws(边界bc)

(14)

wd(z,r=D/2,t)=0.9ws(边界cd)

(15)

(16)

模型的求解采用有限元法，所有计算均在COMSOL Multiphysics®软件中实现，计算区域的网格划分如图2所示(经检验已足够密)。模型计算所需的参数值如表1所示[8]。

图2 计算区域和网格划分Fig.2 Computational area and its meshing

表1模型计算所需参数值
Tab.1Parametervaluesneededinthemodelcalculation

V^/(mL/g)MTg/KV^*/(mL/g)(K1/γ)/[mL/(g·K)]K2/Kabcχ水118.0151360.911.945×10-3-19.73二甲亚砜0.9178.133154.750.83.66×10-424.11其它0.8237-2.4108-16.5338-0.4617

2 骨软骨栓的LTM处理方案

Pegg等提出的针对直径6 mm、厚1 mm的羊关节软骨片的LTM方案如表2所示[7]。应用构建的数学模型对该方案处理同样软骨组织尺寸的骨软骨栓的可行性进行了数值分析，其中二甲亚砜溶液的平衡冻结点采用Pegg提出的公式[10]计算：

tm=A·S+B·S2+C·S3

(17)

式中，tm为平衡冻结点温度(℃)，S为总溶质(二甲亚砜+氯化钠)的浓度(g/100 g)，A、B和C为三个系数，分别为：

A=-0.6+0.17tan-1(R)

(18)

(19)

C=-0.00045

(20)

式中，R表示二甲亚砜与氯化钠的质量之比。

如图3所示，在处理溶液温度低于0℃的冷却加载步骤中，点a处(见图1)的二甲亚砜浓度对应的平衡冻结点温度均要高于处理溶液温度，即骨软骨栓处于过冷状态，而且过冷度随着温度的降低而增大，最大达到约30℃，冰晶将极有可能在软骨组织内形成。因此，对于骨软骨栓，需要设计新的处理方案。

表2羊关节软骨片的液相线跟踪法处理方案

Tab.2TheLTMprotocolforovinearticularcartilagediscs

步骤处理溶液温度/℃处理溶液浓度/[%(w/w)]处理时间/min冷却加载阶段122101022220103-529304-8.538305-1647306-2356307-3563308-48.57230复温洗脱阶段1-48.563302-3556303-2347304-1638305-8.529306-52030722045总步数:15步总时间:425min

表3为依据如下思路而建立的方案。

1)冷却加载和复温洗脱阶段各步的处理溶液温度和处理溶液浓度与现有方案的相同。

2)对于冷却加载阶段的某一步，当其接下来一步的处理溶液温度低于0℃时，该步的处理时间应

图3 冷却加载和复温洗脱阶段，处理溶液温度、骨软骨栓点a处二甲亚砜浓度及其对应的平衡冻结点温度随时间的变化Fig.3 Time courses of the treatment temperature, the concentration of dimethyl sulfoxide at point a of the osteochondral dowel and its corresponding freezing temperature during the stages of cooling-addition and rewarming-removal

步骤处理溶液温度/℃处理溶液浓度/[%(w/w)]处理时间/min点a处二甲亚砜浓度/[%(w/w)]平衡冻结点/℃冷却加载阶段122.01010.01.29222.02044.015.73-5.03-5.02966.023.23-8.54-8.53894.432.22-16.05-16.04774.037.62-23.06-23.05697.644.30-357-35.06392.447.50复温洗脱阶段1-35.05692.42-23.04797.63-16.03874.04-8.52994.45-5.02066.0622.00109.2总步数:13步总时间:1012min

注：表中所给平衡冻结点数值根据每一步加载处理终了，骨软骨栓点a处二甲亚砜浓度计算得到。

Note：The equilibrium freezing point was calculated from the addition end dimethyl sulfoxide concentration at pointaof the osteochondral dowel for each treatment step.

使得该步终了骨软骨栓点a处(如图1)达到的二甲亚砜浓度对应的平衡冻结点温度等于接下来一步的处理溶液温度，即软骨组织不过冷。

3)当骨软骨栓点a处浓度达到47.5%(w/w)时，冷却加载阶段结束[11]。

4)假设当软骨组织内二甲亚砜的平均浓度降至0.1%(w/w)时，复温洗脱阶段结束。

对比表1和表3可以看出，骨软骨栓的保护剂处理时间远远长于软骨片，其原因在于：1)同样软骨体积的骨软骨栓相比于软骨片，可渗透表面的面积减少了37.5%；2)骨软骨栓点a离可渗透表面的距离大于同样软骨厚度的软骨片中心点离表面的距离，即传质距离增大了。

对于传质面积减少、传质距离增大的骨软骨栓，传质阻力将是液相线跟踪法的重要制约因素，特别是在低温下。尽量减少二甲亚砜的载入量，对软骨内二甲亚砜的最终载入浓度进行优化研究，能够缩短LTM的处理时间[11]。另外，也可以设法加速二甲亚砜渗透关节软骨的过程。对软骨这种特殊的受力组织，可以考虑采用周期性挤压法来强化传质过程：软骨片在被压缩的过程中排出存在于基质间的流体，在接下来的松弛过程中，软骨片在自身弹力的作用下逐渐恢复原状，在此过程中吸入周围的溶液。在生物力学领域，就有人通过周期性挤压法来加速化学物质在软骨内的渗透，如Quinn等采用周期性挤压法加速右旋糖苷的渗透[12]。

3 结论

本研究应用二甲亚砜渗透关节软骨的数学模型，通过数值分析发现，当现有LTM方案应用于同样软骨尺寸的骨软骨栓时将产生较大的过冷度，冰晶将极有可能在软骨组织内形成，为此以避免软骨细胞在处理过程中遭受冰晶损伤为目标，提出了直径6 mm、软骨厚1 mm的骨软骨栓的LTM处理方案，方案共13步，耗时1 012 min。本研究提出的处理方案以及方案的设计思路对玻璃化保存骨软骨栓的成功实施具有一定的指导和参考价值。

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Study on Treatment of Osteochondral Dowels by Liquidus-tracking Method

Yu Xiaoyi1Zhang Shaozhi2Chen Guangming1,2*

1(Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo 315100, Zhejiang, China)2(Institute of Refrigeration and Cryogenics, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

articular cartilage; vitrification; liquidus-tracking method; mass transfer; mathematical modeling

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 03.017

2014-09-17， 录用日期：2014-11-17

国家自然科学基金(51406180)；中国科学院低温工程学重点实验室开放基金(CRYO201416)；浙江省教育厅科研项目(Y201432759)

R318.52

D

0258-8021(2015) 03-0376-05

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: gmchen@zju.edu.cn